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中生网 > 实验技术 > 动物实验 > 普鲁卡因小鼠腹腔注射LD50的测定

普鲁卡因小鼠腹腔注射LD50的测定

更新:2007年08月02日 阅读次数: 【字体:

广东药学院    谭毓治
 
  【目的】通过实验学习测定药物LD50的方法、步骤及计算过程,观察受试药品一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况。
  【原理】药物给药剂量与动物死亡率间呈正态分布,以对数剂量为横坐标、死亡率为纵坐标作图,可得到一对称S型曲线,其两端较平坦,中间较陡,说明两端处剂量稍有变化时死亡率的改变不易表现出来,在50%死亡率处斜率最大,该处剂量稍有变动时,其死亡率变动最明显,即最灵敏,在技术上也最容易测得准确,所以人们常选用LD50值作为反映药物的指标。若将死亡率换算成机率单位,则对数剂量与机率单位呈直线关系,用数学方法可拟合其回归方程式,可精确地计算LD50及引起任何死亡率的剂量及相关数据。
  【器材】注射器(1ml)、天平、小鼠笼、苦味酸。
  【药品】盐酸普鲁卡因
  【动物】18~22g健康小鼠50只(正式试验),雌雄各半(雌鼠应无孕),实验前禁食12h,不禁水。
  【方法】
  1.预试验  目的是寻找引起0%和100%动物死亡的剂量范围,以便正式实验时确定各组剂量。一般是取小鼠9~12只,分3~4组,选择组距较大的一系列剂量腹腔注射给药,观察出现的症状并记录死亡数,找出引起0%及100%死亡率,至少应找出引起20%~80%死亡率的剂量范围,以保证量-效曲线跨越足够的范围。普鲁卡因小鼠腹腔注射(ip)引起0%和100%动物死亡的剂量范围的参考值为:最小剂量(Dmin)121.3mg/kg,最大剂量(Dmax) 290mg/kg。
  2.剂量计算及药液配制
(1)剂量计算
根据预试结果找出Dmax及Dmin,设正式实验的剂量组数为n,剂量公比为r,则
各组剂量为Dmax·rk-1,k为第几组,一般选用4~5组动物,r为0.6~0.85为宜。
   例  已知普鲁卡因Dmin=121.3mg/kg, Dmax=290mg/kg
  当n=6时,r=0.84,  各组剂量为:
1.     290 mg/kg
2.     290 mg/kg×0.84 = 243.6mg/kg
3.     290 mg/kg×0.842= 204.6mg/kg
4.     290 mg/kg×0.843= 171.9mg/kg
5.     290 mg/kg×0.844= 144.4mg/kg
6.     290 mg/kg×0.845= 121.3mg/kg
  (2)药液配制
①药源充足时的配药方法
最高浓度药液(母液)的配制
  小鼠腹腔注射体积为0.2ml/10g= 20ml/kg,每组药液量为4ml左右,为留有余地,各组动物所需药液体积定为6ml。
  求出所需母液体积(V)及母液所需药量(M)
V=各组动物所需药液体积 / (1-r)= 6 / (1-0.84)=37.5ml
M = V ´ Dmax/(20ml/kg)=37.5´(290/kg) /(20ml/kg)=543.75mg
各剂量组药液按下法稀释:
      543.75mg+生理盐水至37.5ml,混匀 → 第一组取6ml
                     ↓
                   31.5ml+生理盐水6ml,混匀 → 第二组取6ml
                         ↓
                       31.5ml+生理盐水6ml,混匀→ 第三组取6ml
                             ↓
                           31.5ml+生理盐水6ml,混匀 → 第四组取6ml
                                 ↓
                               31.5ml+生量盐水6ml,混匀 → 第五组取6ml
                                     ↓
                                   31.5ml+生理盐水6ml,混匀,为第六组药液
                   
  ②药源紧张时的配药法
  各组所需母液的体积(ml)为:
第一组 6
第三组 6´r2
第五组 6´r4
第二组 6´r
第四组 6´r3
第六组 6´r5

母液总体积(V)=6´(1+ r+ r2+ r3+ r4+ r5)
总药量(M)=母液总体积´Dmax/(20ml/kg)
计算出V、M后,取药量M,用生理盐水稀释至Vml,用移液管精密吸取各组所需的母液量,加生理盐水稀释至6ml,即为各组试验药液。
  3.动物分组:将小鼠雌、雄分开。分别称重,同一重量段(如 18.0—18.9g)小鼠放入一个笼内,标记小鼠。雌、雄小鼠分别按重量顺序分层随机分为6组,使不同性别和体重的小鼠能均匀分配于各组,每组10只。
  4.给药:各组动物分别腹腔注射相应浓度的药液0.2ml/10g,立即详细观察,记录动物反应情况、死亡时间和数目。在24h内作多次观察,以后每天观察1次以上,连续观察7~14天。按Bliss法及其它方法计算LD50和95%可信限(由于Bliss法计算复杂,可用相关的软件进行处理)。
【结果】记录于表T1-1。
组别
剂量
(mg/kg)
对数剂量
(X)
动物数
(只)
死亡动物数
(只)
死亡率
(%)
几率单位
(Y)
LD50及95%置信限
1
 
 
 
 
 
 
 
2
 
 
 
 
 
 
3
 
 
 
 
 
 
4
 
 
 
 
 
 
5
 
 
 
 
 
 
6
 
 
 
 
 
 

  【注意】
  (1) 随机性:实验中能控制的因素尽量使之均衡化,难以控制的因素也应力求严格随机化。分组时应先将不同性别分开,再将不同体重分开,然后随机分配,此法称为分层随机分组法。
  (2)剂量按几何级数排列,转换为对数后,剂间为等距,便于计算结果,估计误差。相邻高低剂量之比一般为1:0.6~1:0.85,剂距小,结果较精确,但过小易出现反应率颠倒的情况。剂距的大小也与给药途径有关,静脉给药时,剂距可偏小,灌胃给药时可适当偏大。
(3)药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主,选取的途径必须包括推荐临床给药途径。
(4)LD50受试验中多种因素的影响,如动物的品系、性别、年龄、饥饱以及环境因素中室温、湿度、光照、时辰(上、下午)等。当进行两药的毒性比较时,应尽可能在相同条件下进行,以减少抽样误差。
(5)在试验过程中应详细记动物的中毒症状及可能致死原因,必要时解剖死亡动物肉眼观察,如发现有组织病变时,可进行组织学检查,通常动物死亡多出现在给药后1~2日内,但全部试验应观察7日以上,如遇有迟发性或进行性中毒反应时,需根据实际情况延长观察时间。若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别,则应选择比较敏感的性别进行试验。
(6)当药物毒性小,以最大浓度和最大体积给药后仍测不出致死毒性时,可测定最大耐受量: 即用临床试验的给药途径,以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次或1日内连续2~3次给予动物(小白鼠至少20只,雌雄各半),连续观察7天,详细记录动物反应情况,以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。
关键词:普鲁卡因
相关栏目:实验技术 动物实验
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