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DNA测序仪工作原理和操作方法

更新:2010年09月12日 阅读次数: 【字体:

DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。

一、原理

ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。

由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

二、试剂与器材

1.BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。

2.pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L,试剂盒配套试剂。

3.M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。

4.DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。

5.引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。

6.灭菌去离子水或三蒸水。

7.0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离,PE公司产品。

8.3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。

9.70%乙醇和无水乙醇。

10.NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。

11.POP 6测序胶ABI产品。

12.模板抑制试剂(TSR) ABI产品。

13.10×电泳缓冲液ABI产品。

14.ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。

15.2400型或9600型PCR仪。

16.台式冷冻高速离心机。

17.台式高速离心机或袖珍离心机。

关键词:DNA测序仪
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