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中生网 > 仪器设备 > 仪器介绍 > DNA测序仪工作原理和操作方法

DNA测序仪工作原理和操作方法

更新:2010年09月12日 阅读次数: 【字体:

三、操作步骤

1.PCR测序反应

(1) 取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix      1μl    1μl

待测的质粒DNA      1μl    -

pGEM-3Zf (+) 双链DNA     - 1μl

待测DNA的正向引物   1μl    -

M13(-21)引物- 1μl

灭菌去离子水  2μl    2μl

总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。

(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。

2.醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。

(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1) 加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心。

(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min),冰中骤冷,待上机。

4.上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

四、结果计算

测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%

差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。

五、注意事项与评价

1.ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。

2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。

3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。

4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5)%,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。

关键词:DNA测序仪
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