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免疫测定技术的应用和发展趋势

更新:2008年09月05日 阅读次数: 【字体:
免疫测定技术自本世纪50年代发展至今。出现了各种的测定和测定模式,在临床上广为应用。面对即将到来的21世纪,免疫测定技术将会朝着什么样的方向发展?前景又如何?本文拟就近几年免疫测定技术的研究动向作一概述并对其未来发展趋势提出一点个人的看法。
1、基因工程试剂对疫测定技术发展的影响
(1) 基因工程抗原 
最早在HIV抗体免疫测定中所使用的抗原为用去垢剂裂解HIV感染的细胞后所提取的病毒抗原,这样得到的抗原纯度相对较差,因此影响测定的特异性和敏感性。现在国内外用于HIV抗体检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)均使用基因工程抗原如gp41,gp120,gp160等,大大提高了测定的特异性和敏感性。
HCV目前尚不能体外培养,只能用基因工程或化学合成的方法获得HCV结构区和非结构区的各种抗原片段。已知HCV基因组由7个功能区组成;核心、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4和NS5区。最近,美国Chiron公司Chien等研制了一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白,称为多表位融合抗原-6(Mutiple-epitope fusion antigen, MEFA-6)。使用该融合蛋白建立的化学发光免疫测定方法,其测定敏感性较使用由NS3-NS4核心(C25)区组成的融合蛋白所建立的酶免疫测定方法要高2-4倍。
此外,近年来不少研究者采用基因工程技术重组表达了梅毒螺旋体的具有高度免疫原性的膜脂蛋白TpN17、TpN44.5(TmpA)和TpN47等,用其建立梅毒抗体检测的ELISA方法,表现了很好的测定特异性和敏感性,将成为取你快速血浆反应素环状片试验(Rapid plasma reagin circle card test, RPR)和螺旋体血球凝集试验(Treponemal pallidum hemagglutination assay, TPHA)的梅毒抗体理想的检测方法。
由上述可见,基因工程抗原对建立高灵敏高特异的免疫测定方法具有不可替代的作用,已成为难以培养的病原体抗原的最佳来源,亦解决了病原体裂解提取抗原纯度差的问题。综观未来,基因工程抗原在免疫测定中的应用,有其独特的魅力和广阔的应用前景。其发展趋势如下:(1)由单一病原体蛋白向多决定簇融合蛋白转变,并尽可能地包括病原体基因组功能区的所有的能引起机体强免疫应答的决定簇。(2)所表达的重组抗原将不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原。(3)为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片段等。总而言之,将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基在工程抗原。
(2)  基因工程抗体及其双功能试剂 
80年代末,人们开始使用基因工程技术制备抗体,并进而将抗体分子片段与其其它蛋白(或另一种抗体分子)融合得到多功能试剂。到目前为止,基因工程抗体在免疫测定上的应用尚处初级阶段,且主要是将抗体与其它蛋白以融合蛋白形式表达而得的多功能试剂。如澳大利亚学者应用基因工程技术制备了抗人工细胞抗体与HIV-1gp41的融合蛋白。其构建了重组的单链Fv(Single chain,Fv,scFv)抗体片段,scFv由抗红细胞膜血型糖蛋白抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区(V1)组成,其间由15个残基-(GGGGS)3-连接体相连,在轻链可变区末端有来自HIV-1 gp41表面糖蛋白C末端八肽尾(FLAG)或-35肽。将此构建克隆入大肠杆菌表达载体pHFA,培养后,得到重组蛋白,即基因工程双功能试剂。在此基础上,建立了快速、灵敏和特异的自身红细胞凝集试验。
基因工程抗体及其双功能试剂由于抗体分子小型化,因而具有较好的测定灵活性,无疑具有很好的应用前景。并且由于基因工程技术不但可将两种不同的蛋白分子以融合蛋白形式同时表达,而且可将多种功能的蛋白基因构建在一起。因此,多功能(三种以上)免疫测定试剂不应该是一个梦想,其研究应用将使得多项标志物的快速方便的同时检测变为现实。
基因工程酶及其融合蛋白   除了基因工程抗原抗体外,与标记免疫测定有关的另一种重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白。以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是CEDIATM均相酶免疫试验。该测定方法的建立,对于均相酶免疫测定是一个突破,其最大的特点是具有较高的测定敏感性和线性化的剂量反应曲线,这是一般竞争均相酶免疫测定方法所没有的,现已有商品试剂盒供应。
使用基因工程技术生产免疫测定标记用酶,是得到符合标记要求的高纯度的一条新途径,且如直接以其它蛋白(抗体或抗原)融合的方式表达,不但避免了繁琐且低效率的酶与酶与蛋白的化学交联,而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原。随着分子生折学技术的发展,将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶和其融合蛋白的基础之上。
2、新型标记物对免疫测定技术发展的影响
近年来,作为免疫测定发展方向的非同素标记测定技术倍受关注,其进展主要表现在元素和核酸标记免疫测定方法的出现。
元素标记免疫测定技术较早出现的是以镧系元素作为标记物的时间分辨荧光免疫分析(Time-re-solved fluoroimmunosassay, TRFIA)。较新的元素标记免疫测定方法是Roche-Boehringer Mannheim开发的以钌作标记的电化学发光免疫测定(Electrochemilu-minescence immunoassay, ECLIA)技术,商品名称为Elecsys免疫分析系统,其测定灵敏度较通常的化学发光测定方法要高得多。
以核酸作为标记物设计免疫测定方法是以DNA的放增或转录翻译为基础的。DNA与同位素、酸产、荧光素或元素不同,本身并无指示特性,但其可通过PCR在数小时扩增数百万倍,这种信号放大远非同位素、酶等通常的标记物所能及,因而具有极高的检测灵敏度。而转录翻译则是将编码酶如荧火虫荧光酶和β-半乳糖苷酶α肽的DNA片段标记抗体,抗原抗体固相反应后再对DNA进行细胞外翻译转录成相应的酶进行测定。由于一个DNA分子经转录可得多个mRNA分子,同时一个DNA分子经翻译又中生成数个蛋白分子,因此也具有很高的测定敏感性。
自多标记免疫测定技术发展以来,发现和应用新的标记物一直是免疫测定技术的主要研究方向之一。开发和应用新的标记物,其目的无非是为了提高免疫测定的灵敏度、特异性和稳定性。比较来看,元素标记免疫测定技术较为成熟,且无自动化,仪器及配套试剂均已有商品供应。DNA标记免疫测定尚处于科研阶段,由于基因扩增或转录翻译相对操作复杂,因而目前还没有商品试制盒供应。但DNA标记免疫测定在信号检测上无需特殊的仪器设备,且在测定的敏感性上是其它任何已有的标记免疫测定技术所不及的,随着基在扩增技术的发展及其标准化,DNA标记免疫测定技术的临床应用将成为现实。
3、同时测定多项标志物的方向
近年来有人采用两种不同的酶如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记两种特异性抗体(如抗HBs和抗人IgG),反应后用其各自的酶底物显色,从而测定两种不同的血清标志物HbsAg和抗HCV。也有研究者用不同的多个DNA标记抗体,抗原抗体反应完成后,再用多对引物进行PCR,根据特异的DNA扩增产物即中同时测定多个标志物。此外使用不同的荧光素或元素标记两种以上的抗体,亦可同时进行两种以上标志物的测定。
使用标记免疫测定方法同时测定两种以上的标志物,对于某些常需一起测定的标志物的临床应用来说,可节省测定操作时间,减轻技术人员的劳动强度,求较高,目前基本上处于研究阶段,但在未来数年里,应有望得到应用,如在献血员的筛选中,通常须测定HbsAg、抗HCV、抗HIV和梅毒抗体等血清传染性指标,如这几项指标的两项或更多项能同时测定,则对血站实验室技术人员就相当方便。
4、免疫测定的自动化
近年来,各种基于不同原理全自动免疫测定分析仪在临床实验中应用越来越多,不但减轻了实验室人员的劳动强度,而且大大提高了测定的准确性和重复性。目前,在实验室可见到的全自动免疫测定分析仪的测定原理主要有酶免疫、免疫比浊、化学发光、电子发光、荧光偏振以及时间分辨荧光免疫测定等。除了酶免疫测定外,基于其它原理的全自动免疫分析仪均为试剂“限定”,即必须使用与仪器配套的测定试剂,而有些全自动酶免疫分析系统则属于开放式的,符合标准的各种品牌的ELISA试剂盒均可应用,这样的全自动免疫分析仪灵活性较好,也比较经济,因为与全自动免疫分析配套的进口试剂往往相当昂贵,这一点往往限制了全自动免疫分析仪在基层实验室的应用。
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