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免疫荧光 | ||
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问题 |
可能的原因 |
解决方法 |
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信号弱或无信号，染色细胞过少 |
目标蛋白在细胞中没有表达 |
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表达目标蛋白的细胞过少 |
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细胞通透性差 |
增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其他的通透剂 | |
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染色前的固定步骤破坏了抗原表位 |
改用其他固定方法 | |
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通透使抗原丢失 |
减少通透剂作用的时间或强度 | |
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抗体不识别 |
换用其他抗体 | |
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一抗稀释度过大 |
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | |
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二抗选择错误 |
使用正确的二抗 | |
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背景过高 |
一抗质量不高 |
使用特异性高，效价高的一抗 |
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一抗浓度太高 |
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | |
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二抗浓度太高 |
同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释比例 | |
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封闭不完全 |
使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件 | |
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封闭液BSA中含IgG |
使用高纯度（IgG free）的BSA | |
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洗涤不充分 |
充分洗涤 | |
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细胞呈扁平状或像撞击坑 |
细胞片被风干 |
在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 |
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使用了甲醇固定 |
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细胞有自发荧光 |
使用了戊二醛固定 |
在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
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材料本身（如石蜡）有自发荧光 | ||
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细胞模糊，封片剂明亮 |
因洗涤不充分导致背景太亮 |
充分洗涤 |
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二抗结合太弱 |
确保抗体牢固结合，确保固定良好 | |
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整个细胞片都出现荧光亮点 |
二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 |
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二抗发生沉淀 |
过滤或离心荧光标记二抗 | |
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免疫细胞（组织）化学 | ||
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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染色弱或者没有染色 |
组织不表达待测抗原或者表达水平太低 |
参照阳性对照片确定为真阴性结果 |
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切片时选错蜡块和选错切片 |
用HE染色验证 | |
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漏加试剂或者试剂使用顺序错误 |
重复实验，确保每一步均正确 | |
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试剂孵育时间不充分 |
确保试剂孵育了足够的时间 | |
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抗体不正确，或检测系统和一抗不匹配 |
选择正确的一抗和匹配的二抗 | |
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底物和酶不匹配 |
选用匹配的底物 | |
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抗体浓度太低 |
通过抗体稀释曲线决定最佳浓度 | |
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色原/底物溶液失效 |
将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。否则需更换新的酶标抗体或底物 | |
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抗体储存不当，导致失效 |
根据抗体说明书进行适当的保存 | |
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一抗失效（过了有效期） |
换用新的一抗 | |
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二抗失效 |
换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？） | |
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冲洗液和反应试剂不匹配 |
检查溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 | |
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脱石腊不充分 |
延长脱腊时间或者换用新的二甲苯 | |
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组织固定不充分或者不当（如温度过高） |
增加固定时间或者改用不同的固定方法 | |
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组织固定过度 |
减少固定时间或4℃固定。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法 | |
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抗原修复方式不当 |
采用合适的抗原修复方式 | |
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细胞内抗原未使用穿孔剂 |
洗液中加入0.05%Triton-100，有助于抗体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc受体 | |
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复染剂、脱水、透明和封片剂和所使用的色原不匹配 |
选择正确的试剂（荧光素染色封片要选用水溶性封片剂，藻胆素蛋白染剂不能用含甘油的封片剂。AEC, AP Red/Fast Red, INF 和其它水溶性染料不能用二甲苯有机溶剂透明） | |
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染色背景高 |
清洗不充分 |
选择适当的清洗液，严格按操作步骤进行 |
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组织含有内源性的酶，如HRP/AP |
在加入一抗之前使用新鲜配制的3%的H2O2-甲醇封闭内源性HRP活性，使用左旋咪唑（levamisole） 溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统 | |
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组织含有内源性生物素（尤其肾脏、肝和脾） |
在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法 | |
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一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高 |
增加一抗的稀释度 ，或选用特异性更好，纯度和效价更高的抗体 | |
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二抗和组织非特异性结合 |
使用与二抗动物的正常血清（一般是3-10%）封闭，必要时可以将血清浓度加大；或者用其它无关蛋白，如牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭 | |
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组织抗原弥散 |
染色结构不清，主要见于冰冻切片固定不及时造成。切片后应立即固定 | |
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使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织 |
在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂 | |
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切片干透 |
保持在高湿环境中，避免干透 | |
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染色过度 |
一抗或者二抗浓度过高 |
降低抗体浓度，通过抗体稀释曲线确定最佳浓度 |
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孵育时间过长 |
减少孵育时间 | |
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孵育温度太高 |
降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者室温 | |
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底物孵育时间过长 |
减少孵育时间 | |
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干片 |
染色过程中避免出现干片现象 | |
