亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素(主要是异硫氰酸荧光黄，fluorescein isoth iocyanate,FITC)与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变，在特定条件下用其着染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在；如果标本中不存在相应抗原，两者便不能结合，水洗时，荧光抗体便被洗掉，因而标本在荧光显微镜下观察不呈现特异荧光。因此，可以根据荧光的有无及强弱来判定抗原与抗体是否存在或相对应。
二、 标本的制备、固定与保存
(一) 标本制备标本的制备应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤及固定过程中不发生溶解或变性，也不会扩散到邻近细胞或组织间隙中去。此外，为了便于抗原和抗体接触，形成抗原抗体复合物，以及有利于观察和记录，要求制备的标本尽量薄，对标本中干扰抗原抗体反应的物质应充分洗涤除去，以免影响标本的观察及结果的判定。
1．病料等标本在一般诊断工作中最常用，适用于检查细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣、穿刺液以及感染动物的脏器和病变组织等，均可以做成涂片或压印片标本。
(1) 涂片方法：先将玻片通过火焰3次，冷却后，以白金耳挑选被检材料均匀涂布成约1cm的圆形涂片。如材料太浓，则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上，用白金耳取材料与其混合稀释，待均匀后涂片，也可将生理盐水加入被检材料中，混合均匀后涂片。涂好后，晾干或以电风扇吹干备用。
(2) 压印片方法：用无菌剪子将待检组织剪开，用无菌的清洁干净棉球或滤纸将切面的血液吸干，然后以玻片轻压切面，使之沾上1~2层细胞，然后再在玻片另一处以切面涂拭，得一较厚抹片，面积按需要而定，标本晾干或吹干。对于容易脱落的材料，如炭疽杆菌等的液体培养物或钩端螺旋体等，在压片之前，载玻片上应加入适量的粘稠物(如2%~5%蛋清等)，以防压印的标本脱落。
2．组织培养标本利用免疫荧光技术研究病毒时，多用组织培养的细胞。较好的方法是在方瓶或雷顿瓶内放半片盖玻片，培养的细胞在其上生长成单层以供使用。培养的细胞一般比组织中的细胞大而薄，适用于观察细胞内特异性抗原的详细分布情况，因为能分辨出在核内或在细胞质内的抗原。特别是研究病毒在细胞内的繁殖情况时，用这种方法制备的标本比其它方法好。
(二) 标本的固定被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节，往往对荧光染色效果表现明显的影响。如所用固定条件不同，荧光抗体染色的抗原在细胞内的分布和形态就会发生变化。所以，当解释染色效果时，要注意固定条件的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外，一般均应先固定，然后进行荧光抗体染色。固定的目的及原则如下：
(1) 固定的目的：①防止被检材料从玻片上脱落；②清除阻止抗原抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片标本固定后，在-20℃下可保存一年，而不改变其染色性。
(2) 固定的原则：①不损伤细胞内的抗原；②不损伤细胞的形态；③固定后应保持细胞膜的通透性，以便抗体和抗原结合。
由于实验目的不同，须选用不同的固定剂，如研究免疫球蛋白时，用四氯化碳比用丙酮固定好，因除组织内结合的球蛋白外，其它游离的球蛋白全被消除。固定后，须立即以pH值74 PBS浸泡冲洗，程序是经过三缸浸泡，每缸3min，末次再通过一缸pH值74的蒸馏水脱盐，否则因脂类存留，而增强自发荧光和非特异性荧光的出现。
(三) 标本的保存固定和干燥好的标本，应尽快进行染色镜检，如必须保存时，应在4℃以下干燥保存。若保存时间长了，抗原的活性会丧失，不能被荧光抗体染色，且组织的自发荧光很强，不能使用，在室温中这种变化更快。在低温中究竟能放置多长时间，因抗原的种类、标本和固定方法等不同而异。在4℃以下干燥环境中或在-20℃下保存，大致可保存1周至1个月左右。石蜡或碳蜡包埋的切片比冰冻切片保存时间长。标本保存一段时间后，其pH值会发生改变(偏酸)，产生阳离子，而抗体球蛋白是阴离子，结果细胞组织和抗体结合产生假阳性。为了避免这一现象，保存的标本在染色前应用pH值76~80的001~002M的PBS处理，改正标本的pH值，而后进行染色。
