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影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

更新:2010年10月25日 阅读次数: 【字体:

简要:使用MARCM技术可以在果蝇活体内正向标记基因突变的细胞(positively labeling mutant cells)。它基于两项已有的技术:FLP/FRT和UAS/Gal4/Gal80。MARCM技术自1999年问世以来,在果蝇神经发育生物学领域起到了举足轻重的作用。这是两位华人科学家Tzumin Lee与Liqun Luo的杰作。

现代的遗传发育学领域虽然五花八门,有些令人眼花缭乱,但基本的指导思想也很简单:在活体动物里增加、减少、或敲除一个或多个基因,继而研究这些基因在体内的生理功能。所以遗传发育学的基本工具分为两大类:一类是让基因表达量提高,另一类是让基因表达量降低或消失。

大部分有重要功能的基因,无论是提高表达,还是敲除,都会导致胚胎期致死。对于关注胚胎后发育的研究者来说,这是一个必须解决的问题。这个问题的解决办法就是制造“嵌合体”(mosaic clone)。“嵌合体”指的是,在生物体中,大部分细胞是正常细胞,个体可以基本正常生长发育,而只有体内的一部分细胞的基因被改变,或者升高,或者降低。这些被改变的细胞群,就称为嵌合体。

在果蝇研究中,如果想在嵌合体中增加基因表达,用UAS/Gal4系统;如果想在嵌合体中敲除基因,用FLP/FRT系统。

UAS/Gal4

在UAS/Gal4系统中,Gal4是来源于酵母的转录因子,而UAS则是其结合调控的DNA序列。因为果蝇基因组不编码Gal4转录因子,所以在果蝇体内过量表达Gal4,不会对果蝇发育产生显著影响。同理,在果蝇体内插入UAS-gene(UAS下游连接着一个待表达的基因)片段,也不会对果蝇产生影响,因为野生型的果蝇没有Gal4转录因子,不能激活UAS。所以,单独含有Gal4或者UAS-gene的果蝇是发育正常的。但如果让这两个果蝇杂交,产生的后代的基因组中同时含有Gal4和UAS-gene,这样,在Gal4的调节之下,这个gene的表达量就会提高 (如下图)。

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

http://www.clas.ufl.edu/jur/200312/papers/paper_lanata.html

这个gene在哪里表达,在什么时候表达,表达多少,要取决于Gal4的表达水平和时空特性。Gal4的表达水平可以通过不同的增强子来调节。在果蝇研究过程中,研究者收集了很多“增强子-Gal4”,可以让其在某个器官里表达,在某一群特定的细胞里表达,也可以在一个特定的细胞里表达。

Gal80也是来源于酵母的一个蛋白,它可以抑制Gal4的活性。Gal80与Gal4相比,被利用的频率要低得多,但有时候会很有用。以下要描述的MARCM技术,就是妙用了Gal80。

FLP/FRT

UAS/Gal4这个来源于酵母的系统可以特异地提高果蝇的基因在体内的表达量,在嵌合体细胞内敲除某个基因的FLP/FRT技术也是来源于酵母。

果蝇有分裂能力的细胞都是双倍体细胞,含有四对染色体,每对染色体中的一条被称为同源染色体,分别来自于母本和父本,它们的基因背景是不一样的。在正常的细胞分裂中,果蝇的一对同源染色体总是能忠诚地复制,然后分配到新分裂的细胞中(如下图)。

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

FLP是一个来自酵母的染色体重组酶,而FRT则是FLP催化的一段DNA序列。如果把FLP和FRT通过转基因导入果蝇基因组中,在FLP的催化下,含有FRT序列的同源染色体会在细胞分裂过程中产生重组。同源染色体重组的结果是:两个后代细胞含有一段只来自于母本或父本的染色体(如下图,比较红圈部分),而不像其他为重组的细胞,一边来自母本,另一边来自父本(如上图)。

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

这种同源染色体重组有什么用呢?用处大得很!如果两条染色体中的一条是正常的,而另一条染色体上的感兴趣基因被突变掉,那么对于绝大部分没有重组的细胞来说,它们是“杂合体”。这些杂合体细胞在绝大部分情况下是正常的,所以果蝇也是基本正常的。对于那些发生同源染色体重组的细胞来说,它产生的两个子细胞中,一个含有双份正常染色体的细胞,而令一个则是含有双份突变染色体的细胞。如果我们在正常染色体上添加标示(例如眼睛颜色,或者GFP),那么,可以在果蝇器官或组织中观察突变细胞的表型变化(如下图,在果蝇幼虫期眼睛皮层中,有GFP的为正常细胞,没有GFP的为突变细胞)。

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

Wu et al., 2003

MARCM

Gal4/UAS可以让基因升,FLP/FRT可以让基因降,而且可以选择性地在特定的细胞里做这些操作。这两个一阴一阳的技术让果蝇遗传学变得很潇洒。但这里面还有“一朵小黑云”,那就是FLP/FRT只局限于在二维的皮层细胞里操作。因为这项技术所标记的细胞是正常细胞,而突变细胞没有标记,如果想看清楚突变细胞,需要组织器官里的细胞很有规律地排列。对于那些具有复杂细胞形态的组织,例如神经组织,我们很难在众多的表达GFP的正常细胞中分辨出那些突变的细胞。

这个问题可能最先由做果蝇神经生物学的人提出来,也由他们来回答了。Tzumin Lee与Liqun Luo在1999年发表了一篇文章,介绍一种可以用GFP标记突变细胞的方法,称为MARCM (mosaic analysis with a repressible cell marker)。这个名字表达了两个含义:1)这是一项基于FLP/FRT的嵌合体技术(mosaic analysis);2)标记嵌合体细胞的方法有些特别,因为用的是a repressible cell marker。MARCM的原理图如下:

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n6/full/nprot.2006.320.html

如上1)所说,MARCM技术包含FLP/FRT,通过同源重组,产生嵌合细胞。为了正向而不是反向标记这些细胞,他们在感兴趣的正常染色体上插入Gal80,同时,在其他区域插入Gal4/UAS-GFP。在正常细胞中,Gal80/Gal4/UAS-GFP在一起,细胞不表达GFP。但一旦FLP/FRT产生嵌合体细胞,有一个细胞含有两份Gal80,不会表达GFP,这是正常细胞;另一个没有Gal80,表达GFP,是感兴趣的嵌合体细胞。如果在不含Gal80的染色体上引入突变(如上图中的星号),那么MARCM技术就能让突变细胞表达GFP,而其余正常细胞则没有GFP。下图是他们把MARCM技术用于神经系统的一个例子:

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

Lee and Luo, 1999 左边为正常神经细胞,右边为突变细胞。

上图显示,正常神经元与突变神经元表现出来的形态很不一样。有了这项技术,可以深入研究基因如何调控神经元存活、形态变化、迁移等等重要的问题。

MARCM技术不但在基因-神经元领域打开了新天地,它也给做其他方向的人提供了一种选择。除了正向标记突变细胞,还可以利用MARCM技术在突变细胞里同时表达别的基因,把loss-of-function与gain-of-function很好地结合起来。这样的例子很多,其中的一个有趣的例子是用于癌基因的研究。

癌基因大概分为两大类:原癌基因(proto-oncogene)和抑癌基因(tumor suppressor)。在癌细胞中,前者活性上升,后者降低。癌症被认为是多个癌基因突变诱发的。Ras是一个重要的原癌基因,而scrib则是一个抑癌基因。只让Ras的表达量升高(下图中左),与正常对照相比(下图左),细胞多了一点;只让scrib突变,细胞数目反而有所下降,因为scrib突变会导致细胞死亡(下图中右);但如果Ras上升+scrib突变,细胞数目增加,并且从原来的位置迁移到了其他地方(下图右)。这是利用果蝇研究癌基因的一个成功的例子。

影响深远的改进:发育遗传学中的MARCM技术

Pagliarini and Xu, 2003

Lee & Luo发明的这项MARCM技术综合了两个已有的技术,是站在巨人肩膀上的一个进步。但这项其貌不扬的技术产生了很大的能量,让果蝇领域以及神经发育领域的人多了一个很有力的工具,可以回答很多以前不能回答的问题。Luo实验室还把MARCM技术推广到了小鼠。但小鼠的遗传学工具与果蝇有很大差别,要把小鼠MARCM做得随心所欲,还有很多技术问题需要解决。

在做这个工作的时候,Lee是博士后,Luo刚刚当上老板。他们现在都是响当当的人物,大家感兴趣可以搜一下,第一个结果肯定是你想要的。(科学网张天翼的博客)

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