. 通过一种分子内可逆的“门闩”结构起到自我抑制作用
有好几种信号传递蛋白都具有自我抑制（Autoinhibition）作用。它们使用的是一种分子内部结构域之间的相互作用机制。当一个上游信号，比如配体结合或磷酸化事件发生之后，就会导致信号传递蛋白内部结构域之间的相互作用不稳定，减弱自我抑制作用，并将信号传递给下游。从能量状态的角度来看，受自我抑制的信号传递蛋白是占多数的状态，但是当抑制作用减弱时，就会出现一些激活态信号传递蛋白。
我们现在已经可以借助核磁共振研究方法和生物化学研究方法，对这种配体信号分子对信号传递蛋白能量状态和动力学状态调控的能力进行定量研究了。目前，我们主要是对人体主要原癌基因Vav进行研究。该基因能将细胞表面受体接收到的信号转移至细胞内。在Vav蛋白信号传递过程中也存在自我抑制作用。一个酸性螺旋结构区域（名为Ac）与Vav Dbl同源蛋白（DH）的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）底物结合位点结合，起到了类似于“门闩”的作用，即自我抑制（图3B）。而在激活状态下，该Ac区域会被取代，不过在没有任何上游信号的情况下，该取代过程很慢，需要花费数微妙至数毫秒。但是如果Ac区域中第174位的酪氨酸（Tyr174）被上游的激酶磷酸化修饰，就会让Ac区域与底物结合位点分离，让蛋白处于激活态（图1C）。不过令人吃惊的是，在Vav DH蛋白的抑制状态中，Tyr174位点是不可及的，因此处于激活态的蛋白数量有限，这也限制了蛋白磷酸化的速率。而且我们用突变的DH蛋白研究发现，激活态蛋白的数量与它们激活下游GEF信号通路的能力成正相关。Ac区域一旦被磷酸化修饰就会丧失稳定的二级结构，变得非常“柔韧”，极富可塑性。Vav蛋白中的Ac区域实际上就是一种蛋白质“内在的不稳定区域”，这些区域在进化过程中没有进化出稳定的结构，因此非常适合进行信号传递工作。
这种自我抑制式的“信号开关”既可以被磷酸化一类的外源方式调控，也可以被蛋白质构象改变等内源方式调控。Crk蛋白是酪氨酸激酶Abl（tyrosine kinase Abl）的胞内调控元件，它由一个SH2结构域和两个SH3结构域组成，其间被长约50个氨基酸的接头序列所隔开。Crk蛋白N末端的SH3结构域能与靶蛋白中富含脯氨酸（proline-rich）的基序结合，但是这种结合会被Crk蛋白C末端的SH3结构域自我抑制掉。这种抑制作用依赖于顺式结构接头序列中Gly237-Pro238的作用。但是当该接头序列以非常缓慢的速度（以秒计）变成反式结构时，就会打开Crk蛋白N末端的SH3结构域，使其能够与富含脯氨酸的配体结合。虽然还不清楚之后发生的下游事件，但我们已经知道，Crk蛋白这种顺式-反式结构转换是受酪氨酸激酶Abl磷酸化作用介导的，Abl对接头序列中Gly237-Pro238附近的酪氨酸进行了磷酸化修饰，改变了接头序列的构象，因此发挥了调控作用。这种转换速度可以受脯氨酰异构酶（prolyl isomerases）调控。反过来，细胞又可以通过对脯氨酰异构酶的调控来控制Crk蛋白的活性。
3. 不稳定的紊乱区域位于动态开关之中
在人类基因组中，大部分外显子都携带有标签氨基酸（signature amino acid）编码信息。这些序列都属于紊乱序列，而我们在研究中发现，在信号传递过程中主要就是这些区域起到动力学改变的作用。通过负向选择机制（negative design，生物体在进化过程中会尽量避免发生某些事件，这被称为负向选择），这些不稳定的紊乱区域保持了能借助多种构象与多个识别位点发生相互作用的功能。有一些固有不稳定区域（IDR）本身就具有分子识别特征。某些IDR区域，比如前文所述的Vav Ac结构域在一定的情况下也能以一种稳定的二级结构与其它蛋白发生相互作用，然后再转变成不稳定状态或者再与另一个配体结合。这些IDR区域的亲和力是由熵（entropy，即该区域在与配体结合过程中有序化的难度）与焓（enthalpy，即该区域形成的最佳结合状态）之间的竞争平衡关系所决定的。这些IDR区域除了具有可延展性之外还具有几何学上的可塑性，因此它们才能够进行转变，起到长度可变的动力学纽带作用。
IDR区域能与多个配体结合的能力使得它们能在信号传递过程当中起到多方面的作用，比如图3C中所示的细胞周期调节蛋白p21就含有IDR区域。同属于细胞周期调节蛋白的p27也含有IDR区域，该IDR区域可以发挥长距离作用将细胞周期依赖性蛋白激酶（Cdk）和细胞周期调节蛋白A（cyclin A）桥接起来。核磁共振研究发现，IDR结合过程是分步进行的，在结合过程中以类似于“飞蝇钓（“fly-casting，一种钓鱼方法）”的方式搜寻配体目标，这就解释了为何在蛋白发生相互作用初期会出现多种亲和力不强的结合配对方式（图3D）。找到合适目标之后，就会同时采用多种相互作用，以多价体式的结合（multivalent binding）方式形成尼龙搭扣那样紧密、牢固的结合。在这种IDR区域与配体结合的同时自身发生折叠（即从不稳定的紊乱状态变成稳定状态）的过程中整个蛋白的熵也会增加。在另一种多价结合过程（即Cdk蛋白抑制剂Sic1被它的受体Cdc4识别的过程）中，Sic1蛋白上的多个不同结合位点都可以与其受体蛋白上的同一位点结合，整个过程就是一个动力学平衡不断被打破又恢复平衡的过程（图3E）。在这种情况下，Sic1蛋白上每一个结合位点与受体蛋白结合时的作用力都非常弱，这使得受体蛋白一直处于活化状态。根据上面所述我们可以发现，在任何信号通路中蛋白间发生的相互作用都是可以通过各种动力学不稳定的基序调控的。
4. 可调控的结构域间相互作用
生物体借助灵活多变的结构域间的结合方式和在信号因子作用下诱发的结构域内动力学以及结构发生的改变方式，最终成功构建了复杂的信号通路网络。生物体所采用的这种策略实际上就是一种“乐高”式的策略（文后小词典）。在进化过程中，生物体只用少量的“材料”就拼凑出了大量丰富多彩、各种各样的信号通路。由于在很多信号通路蛋白中都含有前文中所述的PDZ结构域，于是更进一步增加了信号通路的复杂程度（图2）。这些信号通路蛋白中的结构域在不同的环境影响下可对信号作出不同的反应。比如，在含有5个PDZ结构域的小鼠磷酸酪氨酸磷酸酶BL（phosphotyrosine phosphatase BL）蛋白中，第一个PDZ结构域就可以通过与上述结构域内网络调控模式相似的结构域间调控模式对第二个PDZ结构域的亲和力及特异性进行调节。同样，Rho鸟苷三磷酸酶（GTPase）Cdc42在调控果蝇细胞极性蛋白（Drosophila cell polarity protein）Par-6时也是通过与Par-6蛋白PDZ结构域附近的CRIB结构域相结合来发挥作用的。Cdc42-CRIB结合后会激活PDZ结构域，这是通过CRIB结构域稳定之后在PDZ结构域与配体结合位点的背面与PDZ结构域发生相互作用完成的，这与我们观察到的单独PDZ结构域在信号通路中的作用是相吻合的。通过这种间接的结构域间相互作用对PDZ结构域构象进行的改变增加了它与其配体之间的亲和力，触发了下游细胞极性信号通路。最近，研究人员又在果蝇视觉感光系统里的INAD骨架蛋白中发现了PDZ构象改变的现象。以前我们曾认为INAD骨架蛋白只是一种消极的组织模板。现在的研究发现INAD骨架蛋白里的PDZ5结构域具有氧化还原反应控制开关的作用，它可以在光刺激下将蛋白内部的半胱氨酸氧化，据此来调节与靶蛋白的结合过程，并触发下游信号通路。不过，目前我们对其中的具体细节还没有完全研究清楚。
输入信号也能促进多个结构域之间的聚集与解离（图3F）。Src酪氨酸激酶SH2和SH3结构域都可以进行可逆的聚集与解离，该过程部分受到临近激酶结构域与磷酸酪氨酸结合过程的控制。SH2结构域与结合了磷酸酪氨酸的临近激酶结构域相结合之后，可以促进SH2结构域与SH3结构域之间相互结合，同时灭活激酶活性。当激酶被激活之后，即不再与磷酸酪氨酸结合时，SH2结构域就会与SH3结构域解离。SH2结构域与SH3结构域就处于不断的聚集与解离的过程之中。结构域间的接头序列在这种聚集与解离的过程之中起到了关键性的作用。如果在接头序列中引入突变，该激酶就会形成组成型激活突变体。很明显，结构域间的接头序列偏向于进入活化状态的激酶分子，因为只有这样，才有利于加快灭活的速度（图1D）。这种结构域间的调控作用也见于跨膜C钙粘蛋白（transmembrane C-cadherin protein）。跨膜C钙粘蛋白在细胞发育粘附过程中发挥作用，该蛋白与钙离子结合之后，钙粘蛋白间的可变片段也会固定、稳定下来，从而改变其动力学性质，增强其粘附性。
蛋白在输入信号的作用下对其动力学和结构域构象作出调整，这会改变蛋白在细胞内的定位并加快其降解速度（图3G）。NF-κB转录因子通常都是与其抑制因子IκBα相结合的。IκBα可以部分阻碍NF-κB核定位序列的作用，因此NF-κB就处于是在胞浆内还是进入核内的平衡状态之中。不过，大部分NF-κB分子都位于胞浆内。当IκBα被磷酸化、泛素化修饰之后，就会与NF-κB分子解离，并被降解，于是NF-κB分子得以进入核内，激活靶基因转录。IκBα基因也是靶基因之一，这样也就形成了一个负反馈调控机制。在IκBα蛋白分子中有好几个锚蛋白重复序列结构域（ankyrin repeat domain）。当IκBα与NF-κB结合之后，这些结构域就会固定下来。但是此时IκBα蛋白分子里中间重复序列的可塑性反而增强了。IκB-NF-κB信号通路将基因表达调控机制与信号传导网络完美地联系了起来。目前已经有好几个科研小组开始用数学方法来模拟这条信号通路的作用机制。接下来，我们将要研究信号通路中组成蛋白的动力学特性与整个系统信号通路动力学特性之间的相关性问题。
