中生网|生物技术|生物网址|生物软件|实用工具 |本站导航

生物新闻

-

实验技术

-

软件教程

-

论文考试

-

肿瘤癌症

-

检验知识

-

仪器使用

-

健康知识

中生网 > 生物资讯 > 生物文摘 > 高通量实时荧光定量PCR技术

高通量实时荧光定量PCR技术

更新:2014年08月31日 阅读次数: 【字体:
概述
?(High-Throughput Real-Time PCR),在荧光定量PCR基础上,采用384孔板,利用荧光染料或者探针,同时检测384个样品或者基因的表达分析技术,拥有自动化程度高、低污染、高通量等特点,及时满足了芯片数据验证和大样品基因表达定量的需要,在基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域的应用有广阔的前景。
?
1.???介绍
?基于荧光定量PCR基础上的高通量荧光定量PCR使用的是384孔板,其重复性、准确性和灵敏性均较好,并可同时检测384个基因,与传统荧光定量PCR相比,高通量所测基因数更多,是普通荧光定量的4倍,并且反应体积大大降低,因此,高通量技术节省了试剂和时间。
?
?2.??技术特点
?高通量的定量RT-PCR要求在相同的循环参数下同时对被检测的基因进行扩增,因此需要为每个基因设计具有相同或接近的退火温度和延伸时间的引物和(或)探针,这十分花费时间,所以用传统的定量PCR方法来验证从基因芯片实验中获得的大量数据不够理想,因此验证其中的10到20个目的基因已经很满意。
ABI公司的TaqMan基因表达试剂(TaqMan Gene ExpressionAssay)包括针对不同基因经过优化设计的上、下游扩增引物和标记探针,其特点是对所有被收集的基因可以在一个相同的参数下进行定量PCR反应(具体的循环参数随使用的仪器型号和配套的试剂类型而略有不同),这使得在一次PCR反应中同时检测几十个或几百个基因成为可能。TaqMan低密度芯片是在TaqMan基因表达试剂的基础上,结合微流卡技术研制的进行高通量(384孔)定量PCR反应的平台,本质上与使用普通的96或384孔PCR热循环板并无不同,但在加样操作上,具有节约成本、减少误差等显著优点。比如,在低密度芯片的每个反应孔里,已经按需要验证的基因由机器点样预置了对应的基因表达试剂,反应时只需加入TaqMan PCR主反应液和cDNA模板的混合液,节省了大量手动操作,结合微流卡技术,保证了每个反应孔每种反应成分所占比例的准确性,也降低了交叉污染的机会;低密度芯片上的每个反应孔的反应体积约为2μl,与普通96或384孔板50或20μl的反应体积相比,显然节约了试剂和cDNA模板的使用量。
除此之外,PCR芯片技术,也是基于高通量荧光定量PCR技术的发展。目前PCR 芯片的载体为96 孔或384孔PCR反应板,仅须将制备好的样品cDNA 加入相应的反应孔内,在荧光定量PCR 仪上进行扩增即可。在灵敏度方面,每次扩增仅需400 ng总RNA。高通量PCR 芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物,并且可同时检测高达成百上千个基因,达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。因此,具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。

3.???应用优势:
1)整体性,高通量荧光定量PCR操作系统采用多基因扩增、结果分析一体化,操作简便
2) 时间,PCR芯片检测多个基因的时间是过去PCR检测单个基因的时间;
3) 试剂,传统PCR对试剂用量有要求,15微升以下就很难得到理想的扩增结果,PCR芯片可以扩增10微升以下的样品,这相应减少了试剂如Taq酶的用量,节省了实验经费也减少了废液污染。目前国内启因生物公司能做到1ul的荧光定量反应体系。极大的节省了试剂支出。
因此,与常规的PCR扩增技术相比,PCR芯片具有反应体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠的优点。
高通量实时荧光定量PCR技术
?
?
?4. ? ?数据分析软件
?对大量数据的精准分析,是高通量荧光定量PCR技术所要求的另一特点,除了仪器自带的一些软件可以进行荧光定量PCR数据的分析外,启因生物公司开发的高通量荧光定量PCR数据分析软件,也同样可从多角度全方位地对RT-PCR数据进行深度分析,挖掘出数据所蕴含的意义。
高通量实时荧光定量PCR技术高通量实时荧光定量PCR技术
?

关键词:技术
相关栏目:生物资讯 生物文摘
 以下是对 [高通量实时荧光定量PCR技术] 的评论,总共:0条评论
中生网-生物软件-生物技术-生物网址-实验技术-本站导航-联系我们-收藏本站
©中生网-提供生物软件免费下载,生物实验Protocol,生物网址导航。
Copyright (C)2005-2014 www.seekbio.com All Rights Reserved.