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斑马鱼在中药与天然药物研究开发及质量控制中的应用

更新:2014年08月24日 阅读次数: 【字体:

中药是中国国粹中医的重要组成部分,有悠久的临床使用经验,在复杂疾病治疗及保健和疾病预防方面具有独特优势。但中药也存在一些问题,如成分复杂、作用机制不明、毒性不清、标准不一等问题,中药注射剂引起的安全性问题更是引发了广泛关注。由于中药自身的特点,由体外实验方法和哺乳动物实验构成的化学药物研发体系的药物研发体系并不适合中药的研究和开发。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势,又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点,可以很好地补充和完善现有的药物生物学筛选体系和方法,非常适合用于进行中药和天然药物的研究开发。目前,斑马鱼在中药、天然药物活性成分筛选、作用机制研究以及安全性评价等方面都有着广泛应用,在中药质量控制方面的研究也在深入开展。相信随着斑马鱼药物研发技术将在中药研究开发中发挥积极的推动作用。

在政府的支持和鼓励下,在医药企业的大力推动下,中医药尤其是中药的国际化步伐也正在扎实地向前迈进。中药的主要优势体现在以下几个方面:中医药理论指导的整体辨证施治,多数药材有悠久的临床使用经验,多数中药毒副反应较小,中药复方在治疗复杂疾病方面具有独特优势,以及保健和疾病预防功效显著等。但与此同时,中药也存在很突出的问题,主要有:组分较复杂,有效或毒性成分不清;药物的“有毒”“无毒”多基于经验积累,标准不统一;中药长期潜在的毒性问题研究不够充分;全面药理毒理研究的可借鉴文献少等。药物毒性和安全性不良反应是药物研发失败的主要原因之一,在药物发现和临床前研发阶段,有40%左右的药物因为毒性和安全性问题被淘汰。中医传统理论强调“是药三分毒”,这一方面指出了是药物就不可避免地存在毒副作用,具有非常高的理论指导价值;另一方面,中药中存在着大量有毒副作用甚至剧毒的药材,如何在发挥这些药材药效作用的同时最大限度地抑制其毒副作用是中药面临的严重挑战。研究确认中药组方中的有效活性成分并对其安全性进行评价,以得到“安全、可控、有效”的符合国际标准的复方新药是目前中药现代化的一个重要研究内容。

传统药物临床前研究模式主要包括两个环节:体外实验和体内实验。体外实验(包括细胞实验、生化实验、微生物实验等)具有快速高效的优点,但是体外实验不涉及到药物ADME分析,无法对药物的代谢活性或者代谢产物的活性进行评价,而中药往往在体内代谢之后才会有活性,用体外方法对中药进行的安全性和药效学结果与人体实验结果的可比较差,也很难对中药中的有效活性成分进行很好的评价和筛选。常规的哺乳类动物体内实验(包括老鼠、兔子、狗、猪、猴子及猩猩等哺乳动物实验)可提供可比度较高的筛选评估结果,但一般动物实验周期较长、成本高,不适用于高通量药物筛选。而且哺乳动物(包括老鼠)单次实验药物用量大,中药提取物的制备时间和费用成本都很高,制约了对中药毒理药理的研究进程。

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)是近年来应用越来越广泛的重要模式生物。斑马鱼是一种脊椎动物,与人类基因同源性高达85%,其信号传导通路与人类基本近似,生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似,具有饲养成本地、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察、单次产卵数较高等特点。目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院(NIH)列为继大鼠和小鼠之后的第三大模式生物。目前,在美国及欧洲共有2000多家机构从事斑马鱼相关技术的基础和应用基础研究,并有9家斑马鱼新药筛选公司向全球范围提供商业化服务。斑马鱼模型现已广泛应用于人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价(Rubinstein, A., 2003; Zon, et al., 2005; Kari, G., et al., 2007; McGrath, P.,et al., 2008)。利用斑马鱼模型可以快捷、高效、直观地评价药物的心血管毒性、肝脏毒性、肾毒性和神经毒性等多个主要组织和器官毒性。由多个不同的研究团队进行的研究结果表明,斑马鱼模型对药物心血管毒性、胃肠道毒性、神经毒性和听毒性的评价结果与人体实验结果的一致性平均达到了80%以上,大部分斑马鱼药物毒性与安全性评价模型的预测准确率达到了欧洲选择性分析方法评价中心(ECVAM)评价标准的“良好”(75-85%)或优秀(85%)的水平(Eimon, et al., 2009)。2012年和2013年,辉瑞先后与其它医药巨头合作或单独发表了用斑马鱼进行药物临床前早期肝毒性评价的替代方法研究成果,积极评价了斑马鱼模型在药物早期肝毒性评级中的作用(Hill, et al., 2012;Nadanaciva, et al., 2013)。2013年4月8号,美国FDA在其官网刊文报道斑马鱼在药物早期毒性评价中的积极作用和应用潜力,FDA内部现在已经下设有3个斑马鱼安全毒理学评价实验室。目前,美国食品与药品管理局(FDA)和欧洲药品评估局(EMEA)的已经接受用斑马鱼进行的安全药理学评价数据申报临床实验,标志着斑马鱼药物毒理学与安全性评价模型已经得到了欧美国家政府的正式认可。

斑马鱼模型在药物筛选和药效学评价中应用最早和最广泛的是血管形成抑制剂筛选模型,早在1999年和2002年,Serbedzija(Serbedzija, G. F., et al., 1999)和Childs(Childs S., et al., 2002)就分别证实了斑马鱼血管形成抑制剂模型具有可靠、快速、便捷、直观等优点。斑马鱼也被广泛用于抗肿瘤药物研究,众多的研究成果表明斑马鱼模型在癌症发病机理研究和抗癌药筛选方面具有自身独特的优势(Feitsma Harma, et al., 2008)。目前,用斑马鱼筛选技术筛选(验证)的临床使用或处于临床实验阶段的血管形成抑制剂和抗癌药物已有十八种。Milan等人发现斑马鱼心脏功能和心电图与人的高度相似,并成功建立并验证了斑马鱼心律不齐治疗药物筛选模型(Milan David J., et al., 2006; Macrae, C. A., et al., 2010)。Elo等人(Elo, B., et al., 2007) 用斑马鱼模型成功评价了几种已知的Ⅱ型糖尿病治疗药物的降血糖效果。Clifton等人(Clifton, J. D., et al., 2010)成功建立了斑马鱼降血脂药物筛选模型。斑马鱼高通量、自动化药物筛选模型也取得了很大的突破,进一步推动了斑马鱼模型在药物开发早期阶段的应用(Giacomotto, J., et al., 2010; Carvalho, R., et al., 2011; Pardo-Martin, C., et al., 2010)。

斑马鱼是目前唯一一种可以在96孔板中进行实验的脊椎类动物模型,其给药方式有很多种。药物可以直接溶解在养鱼水中,通过肠道、鳃和皮肤渗透等方式被斑马鱼吸收;也可以通过显微注射,直接注射到斑马鱼卵黄囊(肌肉)、血液循环或者腹腔(成鱼);部分药物开可以采用插管灌胃方式给药(成鱼)。斑马鱼模型灵活多样的给药方式,快速、高效的实验流程,非常适合于进行早期和大规模的中药、天然药物中有效活性成分的筛选和分析分析,有助于对中药、天然药物中活性成分的药理学、作用机制、作用靶点和安全性的研究(Crawford, A. D., et al., 2008; Mandrekar, N. , 2009; Wei, X., et al. , 2010)。Wang等人利用斑马鱼模型从长果桂(Cinnamomum subavenium)中筛选得到了一种能够抑制黑素原形成的活性成分;Crawford等人利用斑马鱼模型从非洲的药用植物中筛选到了2种具有抗血管形成作用的活性成分:大黄素和一种松香烷型二萜(Crawford, A. D., et al.,2011);Hu等用斑马鱼模型从传统中药黄芪(astragali radix)筛选得到了多种能够促进血管再生的活性成分(Hu, G., et al., 2012);Orellana-Paucar等用斑马鱼从姜黄中筛选得到了能够治疗癫痫的活性成分(Orellana-Paucar, A. M., et al.,,2012)。将斑马鱼技术与组学分析结合的天然药物高内涵筛选已经被用于神经类和斑马鱼也被用于对天然产物进行高内涵筛选神经活性物质(Hung, M. W., et al.,2012)。众多的研究结果表明,斑马鱼模型是中药现代化研究方面发挥重大作用的一个新兴模式生物(Littleton, R. M., et al., 2012)。

在与国内医药企业和研究机构合作的过程中,我们也针对国内医药和保健品市场开发了很多有针对性的斑马鱼模型,用于进行中药提取物、中药单味药、中药组方以及含有中药成分的保健品药药效学评价和筛选,发现了一批在癌症辅助治疗、心脑血管疾病治疗、神经保护以及在性保健方面具有显著疗效的中药和天然药物及其组分。这些中药中,既有传统的粉剂、汤剂、膏剂和灌肠剂,也有使用现代工艺生产的中药提取物和注射剂,斑马鱼对不同剂型中药的药效学评价均表现出很好的适用性和可靠性。由于中药具有多组分、多靶点和作用机制不明的特点,使用基于靶点分析的研究方法很有可能会错失中药的某些治疗指证或者有效成分;而斑马鱼发育生物学的深入和广泛研究,为我们提供了一种基于斑马鱼发育表型观察的中药整体药效学评价方法,通过该方法,我们可以先将活性组分筛选出来,然后再逐级深入,研究不同活性组分的作用及其之间的协同作用。斑马鱼模型在优化筛选中药提取工艺方面也有很好的应用价值,在小量提取后,可以通过斑马鱼模型,快速评价不同提取工艺得到的提取产物在药效上是否有差异,比较各种不同提取工艺的优劣,迅速调整提取工艺参数和流程,大大缩短了工艺优化时间和成本。表1列出的是目前已知的部分用斑马鱼模型筛选和评价中药药材活性成分的研究成果。图1是将斑马鱼模型用于中药活性成分研究的路线示意图。

?????????????????????????? 表1 基于 斑马鱼整体动物模型表型筛选的中药药材活性成分研究成果

斑马鱼在中药与天然药物研究开发及质量控制中的应用

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斑马鱼在中药与天然药物研究开发及质量控制中的应用

??????????????? ? ? ? ? ?? 图2.1将斑马鱼动物模型与化学分析方法相结合的中药活性组分研究路线图

除了在中药药效学和活性成分筛选中的应用,斑马鱼在中药和天然药物的安全毒理学评价方面也有广阔的应用前景。国内外的研究都表明,斑马鱼模型在评价中药和天然药物心血管毒性、肝毒性、急性毒性和神经毒性方面有很好的预测性和优势(Crawford, A. D., et al., 2008; Mandrekar, N. , 2009; Wei, X., et al. , 2010)。如前所述,中药的很多成分要经过体内代谢才会有活性,因而,中药的很多毒性也只有经过体内代谢才能发现,这也是体外实验方法在进行中药安全毒理学评价时遇到的最大障碍之一。我们曾经为客户进行中药复方毒性的拆方研究,通过比较复方、单味药以及去掉某种单味药的组方之间的毒性,筛选出有毒副作用的单味药并评价单味药之间是否有明确的减毒增效功能,进而确定是否可以通过去掉某味药材来降低复方的毒性而不会对其药效有很大影响。

中药注射剂是中药现代化过程中产生的一种新的中药产品,在国内已经有非常多的产品上市,但是中药注射剂的不良反应事件已经给中药注射剂的发展甚至生存带来了严峻挑战。在中药注射剂印发的不良反应中,以类过敏反应居多。虽然国家标准里已经有了相关的体外和体内检测方法,但是这些方法在应用于中药注射剂类过敏反应大规模检测时存在很多问题,体外方法在检测中药注射剂中由颗粒状致敏源引起的类过敏反应方面存在不足,而哺乳动物因为检测成本、评价指标标准化等方面的问题也不适合用于大规模质量控制检测。经过自身研究以及与中国食品药品监督管理局(CFDA)食品药品检定研究院和其它研究机构及医药企业的合作,我们已经初步建立了基于斑马鱼整体动物活体微孔板检测类过敏反应的方法,并已初步验证该方法的灵敏度和可靠性,且已申报中国发明专利。后续我们将通过与医药企业的深入合作,对基于斑马鱼的中药注射剂类过敏检测方法做进一步的优化,进一步验证该方法在大规模检测中的灵敏度和可靠性,同时进一步降低检测成本,积极推广该方法在中药注射剂质量检测中的应用。

此外,斑马鱼在中药质量控制方面也有着用武之地。中药药材目前大多来源于人工种植,药材的质量受气候条件影响较大,不同区域甚至同一区域不同年份的药材其药用效果都会很大的波动性,中药质量控制应该体现中药的整体成分、多靶点协同的综合特点。目前的化学分析或指纹图谱等方法理化分析手段难以达到全面揭示其有效成分或特征成分,采用中药生物活性测定方法将是一个值得探索的研究思路(李波等,2012),这将是多组分药物实现现代化和国际化的必经之路和终极目标。在前期研究中,我们建立了斑马鱼高血脂模型,利用斑马鱼高血脂模型建立了一种基于降血脂药效学评价的中成药生物学质量控制标准,有效解决了化学分析或指纹图谱等方法在中药质量控制方面存在的不足,是对中药质量控制体系的重要补充和完善。随着斑马鱼在国内中药研究领域应用的逐步推广,相信基于斑马鱼模型的中药生物学质量控制标准会得到更多的尝试和应用。

经过我们多年来对斑马鱼药物研发技术的积极推广,斑马鱼药物研发技术在国内已经得到了越来越广泛的认可和接受,目前有多家斑马鱼药物筛选和研究机构成立。我们也已经与国内多家中药龙头企业建立了战略合作关系,相信随着斑马鱼药物研发技术在中药研发领域的应用和推广将为中药现代化和国际化增加一股强大的助推力。

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