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PCR替代技术,RPA全攻略之疑难解答

更新:2014年11月04日 阅读次数: 【字体:
重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification,RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDxInc开发)。以此为基础的TwistAmp? 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

之前我们简单介绍了RPA技术的原理和特色,现在你一定对这个技术产生了不少疑问。

RPA反应需要在怎样的温度下进行?

标准TwistAmp?试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行,不过TwistAmp试剂盒已经针对反应速度进行了优化,不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果,TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。

RPA反应能实现多重化么?

可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过,多重化的引物组合需要精心设计,以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是,RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物,就应该控制不同引物的量。另外,我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

RPA反应需要在特殊仪器上进行么?

不需要。对TwistAmp?基础试剂盒和nfo试剂盒而言,只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系(如TwistAmp exo试剂盒),需要能够激发和检测荧光团的恒温装置,比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

RPA反应能对模板进行定量么?

可以。扩增子达到可检出水平的时间,依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多,扩增子就越快达到可检出水平。不过,这种定量需要精心的实验安排,确保对照反应是同时开始的。举例来说,可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系,RPA反应就会开始。

此外,较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?

可以,TwistAmp?基础反应、TwistAmp?nfo和TwistAmp? fpg都可以通过跑胶进行终点分析。不过TwistAmp? exo不行,因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。

扩增反应能进行荧光终点分析么?

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光,荧光增强意味着发生了扩增。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?

支持。在RPA反应中,连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

能用插入性染料实时监控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过,这种染料可以结合任何双链DNA,会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行,这种噪音会比PCR严重一些。此外,不推荐把插入性染料用于TwistAmp exo体系,因为体系中的核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。

RPA试剂能制成master-mix么?

可以。在进行DNA检测时,可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起,重悬冻干的RPApellets。然后将不同DNA加入反应体系,最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时,可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针和一个引物制成master-mix,将其分装到1.5ml小管之后再分别加入不同的引物。注意:只有当两个引物都存在时,才能重悬冻干的RPA pellets,否则重组过程就会有偏向性。

跑胶之前需要回收RPA产物么?

需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳,如果不进行产物回收,跑出来的带会出现拖尾。

RPA反应的扩增子能保存么?

TwistAmp? Basic或nfo的扩增产物可以保存,短期可以放在4°C,保存时间较长的话建议放在-20°C。

TwistAmp? exo (RT)的扩增产物不能保存。因为扩增停止后如果没有及时失活,外切酶III会快速消化扩增子。

TwistAmp? 基础反应的扩增子能进行TA克隆么?

TwistAmp?基础反应中的聚合酶没有编辑功能,扩增子应该是可以用于TA克隆的。不过TwistDx公司还没有针对这项应用进行过测试。

能直接用标记的探针和TwistAmp?基础试剂盒进行侧流层析检测么?

可以。你可以用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测(LFD)。不过TwistDx公司推荐使用探针和TwistAmp nfo试剂盒。这是因为RPA跟PCR差不多,也倾向于形成引物二聚体。如果引物不完美,很容易发生交叉反应,生成假阳性结果。而TwistAmp nfo体系能够避免这个问题。

在用侧流层析试纸进行检测时需要稀释RPA产物么?

是的。RPA反应中的一些物质会干扰试纸上的抗体,如果不能充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。

在TwistAmp? exo (RT)反应即将结束时荧光急剧增强,这正常么?

是正常的。在TwistAmp? exo反应中,聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽,核酸外切酶III开始占据优势,结果导致荧光信号出

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