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原核表达实验步骤

更新:2017年06月05日 阅读次数: 【字体:

一、原理

1、E .coli 表达系统

E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达

提高外源基因表达水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。

二、材料

1、诱导表达材料

(1 )LB (Luria—Bertani))培养基

酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g

NaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%

蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0

(2 )IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中,0 .22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 ml /份,-20 ℃ 保存。

(3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液:

50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (电泳级)

0.1 % 溴酚蓝

10 % 甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 )酶溶法

(1)裂解缓冲液:

50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / ml 溶菌酶。

(4)脱氧胆酸。

(5)1 mg / ml DNase I。

2 )超声破碎法

(1 )TE 缓冲液。

(2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:

100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚蓝

20 % 甘油

三、实验方案

1、外源基因的诱导表达

(1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

(2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

(3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,确定无误后进行下一步。

(4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。

(5 )取上述培养液1 ml ,1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 )细菌的裂解

常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 ml )。弃上清,约每克湿菌加3 ml 裂解缓冲液,悬浮沉淀。

② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶,搅拌20 min ;边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸(在冷室中进行)。

③ 37 ℃ ,玻棒搅拌,溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。

(2 )超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎,在处理少量样品时操作简便,液体量损失较少,同时还可对染色体DNA 进行剪切,大大降低液体的粘稠度。

① 收集1 L 诱导表达的工程菌,40 ℃ ,5000r pm 离心,15 min ;弃上清,约每克湿菌加3 mlTE 缓冲液。

② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌;10 000g 离心,15min ,分别收集上清液和沉淀。

③ 分别取少量上清和沉淀,加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液,进行SDS -PAGE 。

注意事项:超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关,应根据具体情况掌握;超声波破菌前,标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。

2 )包涵体的分离

蛋白质在细菌中的高水平表达,常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒,即为包涵体,经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤,若为获取可溶性的活性蛋白,须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。

(1)试剂与配制

① 洗涤液I:

0.5 % Triton X -100

10 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )

溶于细胞裂解液中。

② 2×凝胶电泳加样缓冲液。

(2)细胞裂解混合物12 000g 离心,15 min ,4 ℃ ;弃上清,沉淀用9× 洗涤液l 悬浮;室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min ,4 ℃ ;吸出上清,用100 μL 水重新悬浮沉淀;分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀,加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液,进行SDS-PAGE 。

3 )包涵体的溶解和复性

(1)试剂与配制

① 缓冲液I:

1 mmol / L PMSF

8mol /L 尿素

10 mmol / L DTT

溶于前述裂解缓冲液中。

② 缓冲液Ⅱ:

50 mmol / L KH2PO4

1 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )

50 mmol / L NaCI

2 mmol / L 还原型谷胱甘肽

1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和HCI 。

④ 2×凝胶电泳加样缓冲液。

(2)用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体;室温放置lh ;加9×缓冲液Ⅱ,室温放置30 min ,用KOH 调pH 到10.7 ;用HCI 调至pH 8 .0 ,在室温放置至少30 min ; 1000g 离心,15 min ,室温;吸出上清液并保留,用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀;取10 μL 上清,加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液,与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。

四、注意事项

(1)不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。

(2)由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工,所以,其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。

(3)表达和检测时,应设置对照组,如转化载体和非诱导细胞。

 
关键词:表达 实验 步骤
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