中生网|生物技术|生物网址|生物软件|实用工具|本站导航

生物新闻

-

实验技术

-

软件教程

-

论文考试

-

肿瘤癌症

-

检验知识

-

仪器使用

-

健康知识

中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > MTT实验步骤详细流程

MTT实验步骤详细流程

更新:2011年01月11日 阅读次数: 【字体:

MTT常用浓度为5mg/ml。

1、药物的细胞毒性

四唑盐(MTT)比色法操作步骤

接种细胞

(1)用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中。

(2)离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞,计数。

(3)将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。

(4)用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液,每孔加0.5×103-10×103 个细胞。

(5)将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。

(6)将培养板放至塑料饭盒中,于37℃湿润环境中温育1-3天,等细胞进入指数生长期时可加入药物。

添加药物

(7)用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释,共制备8个浓度。

(8)对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列各孔的培养基。

(9)在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照。

(10)在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D行可用于第一种药物,E-H行用于第二种药物。

(11)向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。

(12)将培养板放回塑料盒中,温育至确定时间。

生长期

(13)在药物作用期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入200μl新鲜的培养基。

(14)每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。

存活细胞数的估算

(15)在生长期末,每孔中各加入200μl新鲜的培养基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。

(16)用铝箔包裹培养板,于37℃湿润环境中温育4 h。

(17)弃去孔中的培养基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解残留的MTT-甲臜结晶。

(18)在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液(每孔25μl)。

(19)立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。

结果分析

以药物浓度为横坐标(X轴),吸光值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。

2、四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝

四唑盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

无菌材料:生长液;胰蛋白酶(0.25%+EDTA,1mmol/L,溶于PBSA中);MTT: 3- (4,5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑,50mg/ml,滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液(0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH将PH调至10.5 );微滴定板(Linbro,ICN); 微吸头,最好放在高压灭菌的吸头盒中。

非灭菌材料的准备:塑料盒(无毒的聚苯乙烯,装培养板用);加样。

关键词:MTT
相关栏目:实验技术 细胞实验
中生网-生物软件-生物技术-生物网址-实验技术-本站导航-联系我们-收藏本站
©中生网-提供生物软件免费下载,生物实验Protocol,生物网址导航。
Copyright (C)2005-2014 www.seekbio.com All Rights Reserved.