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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 细胞悬浮系的建立与种细胞筛选

细胞悬浮系的建立与种细胞筛选

更新:2013年12月27日 阅读次数: 【字体:
1. 细胞悬浮系的建立
1.1 实验材料
胡萝卜上胚轴经黑暗培养形成的愈伤组织(可与体细胞胚诱导实验同时培养)。
1. 2 培养基
MS无机盐附加:烟酸0.05mg/L、VB6和VB1各0.01mg/L、甘氨酸3mg/L、肌醇100mg/L、激动素0.2mg/L、2,4-D 0.1mg/L、蔗糖20g/L,pH5.8。
1.3 实验操作
a. 按照培养基配方配制液体培养基,分装于200ml三角瓶中,每瓶30-50ml培养基,灭菌待用;
b. 在净化工作台上,将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于含有培养基地三角瓶中。接种量大约为培养基体积的十分之一;
c. 接种后的三角瓶置于摇床上,在转速100rpm,25℃下光照培养;
d. 每隔4周将悬浮培养物继代1次,方法是把5ml培养物转移到50ml新鲜培养基中(1:10),如果有大的细胞块,则在继代时先用一细胞筛过滤除去过大的细胞块,在进行接种。
2. 种细胞的筛选
种细胞的筛选是为细胞次生产物生产提供高产细胞系的中间环节,为了获得高效一致的细胞产量和产物产量,根据不同的植物和产物类型,有不同的筛选方法。其基本操作是单细胞平板培养。
a. 将细胞悬浮系在上述培养基和培养条件下,每隔7天继代一次,每次按细胞悬液与新鲜培养基1:5的比例接种;
b. 将新鲜配制的琼脂培养基在未凝固前,与处于对数生长期的细胞悬浮液按4:1混合后,平铺在培养皿中,操作时特别注意温度不能过高,以免给细胞造成伤害。如果悬浮系中的有过大的细胞团,需过滤除去大的细胞团。
c. 在细胞分裂形成可见的小愈伤组织时,将单个细胞的愈伤组织分别接种在平板培养基上单独培养,由每个细胞形成的愈伤组织即为一个细胞系(clone)。
d. 待愈伤组织长至能检测成分的大小时,取每个愈伤组织的一半用于成分分析,另一半继续培养。成分分析完成后,淘汰不符合要求的愈伤组织,对复合要求的愈伤组织扩大繁殖。
相关栏目:实验技术 细胞实验
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