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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 影响转染效率的主要因素

影响转染效率的主要因素

更新:2014年01月19日 阅读次数: 【字体:
转染效率收多种因素影响,主要因素有下面几个:
1. 细胞培养物
健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基,血清和添加物。低的 细胞代数(<50)能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂 都会有专门的说明。推荐在转染前24 小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA 摄入的可能。一定要避免细菌,支原体或真菌的污染。
2. 血清
大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清(FCS)经常用到,便宜一点的有马或牛血清。 通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生 长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右) 试出对细胞生长良好的血清批号,转染时用同一批号的血清,并同时做负对照(不加转染试 剂及外源DNA)以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下 效率很低,因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死 亡导致转染效率极低。
3. 载体构建
转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR 产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定 的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因 污染)。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺 旋及线性DNA 对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行, 因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体 构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。
4. DNA 质量
DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理, 如果DNA 不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成 及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN 公司提供的超纯质粒抽提试剂盒,能达 到两倍2x CsCl 梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA 质量操心。此外,对一些内毒素 敏感的细胞(如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞),QIAGEN 还提供可去除内毒素污染的质 粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果。
5.转染技术
转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例, 细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE 右旋糖苷法,磷酸钙法,电 穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下:
转染方法原理应用特点
DEAE-右旋糖苷法
带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时 性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清
磷酸钙法
磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染不适用于原代细胞,操作 简便但重复性差,有些细胞不适用。
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定转染,瞬时性转染,所有 细胞适用性广但细胞致死率高,DNA 和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验 条件
阳离子性的脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染,所 有细胞适用性广,转染效率高,重复性好但转染时需除血清
转染效果随细胞类型变化大
病毒介导法
逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染,特定宿主细胞可用于 难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大
细胞需处分裂期,需考虑安全因素,腺病毒瞬时转染,特定宿主细胞可用于难转染的细 胞,需考虑安全因素。
Biolistic 颗粒传递法
将DNA 用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA 在胞内逐步 释放,表达瞬时性转染可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法
用显微操作将DNA 直接注入靶细胞核稳定转染,瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程 改造或转基因动物的胚胎细胞
关键词:转染效率
相关栏目:实验技术 细胞实验
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