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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 小鼠骨髓的染色体制备

小鼠骨髓的染色体制备

更新:2013年12月26日 阅读次数: 【字体:
1. 实验原理 小鼠骨髓细胞有高度的分裂活性,并且数量非常多,因此不必进行体外培养,可直接观察到分裂期细胞。处于分裂期的细胞经秋水仙素处理,阻断纺锤丝的形成,使细胞分裂停止于中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态。低渗处理使细胞破裂,便于染色体分散。该方法在临床上多用于白血病的研究,也可用于观察毒性物质对机体遗传物质——染色体损伤的状况。
小鼠染色体2n=40,均为端着丝粒染色体, 雄性为40,XY,雌性为40,XX。
2. 实验试剂与器材 显微镜、恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、解剖器械(搪瓷解剖盘、剪刀、镊子),注射器、针头、试管、试管架、滴管、载玻片。
0.85%生理盐水、固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)、PBS(pH6.8)、Giemsa染液、秋水仙素(以100μg/ml的浓度溶于0.85%生理盐水中)、0.075mol/L KCl。
3. 实验方法与步骤
(1)秋水仙素处理:取骨髓前3h先给小鼠腹腔注入秋水仙素,注射剂量为100μg/kg动物体重。
(2)取骨髓:用损伤脊髓法处死小鼠,然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉,取出大腿骨,用一小块纱布搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头,然后用注射器吸取5ml 0.85%生理盐水,插入股骨一端,将骨髓细胞冲洗至10ml的离心管中。可重复冲洗多次,直至骨髓腔呈白色为止。
(3)低渗处理:将所获得的细胞悬浮液以 1000rpm离心10min,吸去上清液,留0.2ml沉淀物,加0.075mol/L KCL 溶液(37℃)至8ml刻度,将细胞沉淀物吹散打匀,在37℃水浴低渗25min。
(4)固定:低渗处理后,立即加入1ml新配制且预冷的固定液,抽打均匀,然后1000 rpm离心10min,弃上清。沿管壁加固定液至6ml, 吹散细胞后静止固定10min,即第一次固定。按上述条件离心,去上清液,再次加入固定液至6ml,进行第二次固定。10min后离心吸去上清液,留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液,冲匀制成细胞悬液。
(5)滴片:取事先在冰箱中预冷的载玻片,从约15cm高处向每个载玻片上滴1~2滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上,晾干。
(6)染色:取制片平放在玻璃板上,用1∶9 Giemsa染液染色20min,流水冲洗后晾干。
(7)观察:小白鼠染色体的形态特征,并计算2n的染色体数目。
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