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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 细胞培养技术细胞生物学应用

细胞培养技术细胞生物学应用

更新:2014年01月19日 阅读次数: 【字体:
  生物体是一个高度统一的整体,而的主要对象是生物体内的各种细胞,很显然,在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内(in vivo)的功能活动是非常困难的。细胞培养的意义主要在于两点,其一是人工培养条件易于改变并能严格控制,便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响;其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代,可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。因此,大量生物医学研究工作依赖于细胞培养,许多重要的发现都基于培养细胞的工作。
  细胞培养技术也存在着一定局限性,主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系,失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用,特定分化基因的表达减弱或停止,而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持,遂使体内外细胞出现了差异,这是应用细胞培养技术应该注意的问题。
  细胞培养技术除经典地用于细胞形态结构、功能和细胞活动研究以外,还成为近年发展起来的细胞工程技术的基础,也就是说细胞培养技术重要应用就是各种细胞工程技术。
  一般地,细胞工程指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造,如进行细胞融合、核移植、基因转移等,以获得具有特定生物学特性的细胞。
  (一)细胞融合
  在细胞自然生长情况下,或在其他人为添加因素存在下,使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程,即为细胞融合(cell fusion)。通过细胞融合,可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内,结果形成一个合核体的杂种细胞。在实际工作中常采用各种促融合手段,包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇(PEG)及电激融合法等。在进行细胞融合反应和适当时间的培养后,需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。
  细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。1975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞,即既能在培养条件下长期生长增殖,又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。
  (二)核移植 
  细胞核移植(nuclear transfer)是指将一个双倍体的细胞核(可来自胚胎细胞或体细胞)移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体,并能发育为与供核细胞基因型相同的后代,因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。
  核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。目前均以发育至减数分裂中期II的成熟卵母细胞为受体,供体核则可以采用胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞。核质融合一般是将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后,施加微电流脉冲,使核质融合,形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养,或放入中间受体动物输卵管内孵育,经过一段时间的培养,有的动物需形成桑椹胚或囊胚,再植入受体子宫里。
 (三) 基因转移(gene transfer)
  基因转移指向受体细胞中导入外源基因,是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下,能稳定接纳外源基因的细胞也只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞,一般在转入基因中携带有特定的选择标记,目前应用较多的为细胞抗药性筛选,如根据新霉素抗性基因进行筛选。基因转移又常称为基因转染(gene transfection)。基因转移的方法可分为物理学、化学和生物学三类。
  1. 物理学方法包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射。
  2.化学方法包括DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体法等,其原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加DNA与细胞的吸附而实现基因转移的。这些方法多用于培养细胞的基因转移。
  3.生物学方法主要指病毒介导的基因转移。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体(腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛痘病毒载体)、反转录病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒,感染细胞后仅能将基因组转入细胞,无法产生包装的病毒颗粒。
  (四)细胞治疗与组织工程
  细胞治疗是指用体外培养的正常细胞,或者是导入外源基因的细胞,或者是利用由干细胞诱导分化而来的特定细胞,植入患者病变部位以代偿病变细胞丧失的功能。例如血液系统恶性肿瘤治疗时,通过放疗彻底杀灭肿瘤细胞,同时摧毁患者的造血系统,然后移植健康供者的骨髓,即人们常说的骨髓移植,就是最常见的细胞治疗。
  人胚胎干细胞的建系为细胞治疗提供了更大的可能性。在利用胚胎干细胞作细胞治疗时,首先要考虑克服异体移植中的免疫排斥反应,其方法是将人胚胎干细胞进行MHC基因操作,建立可供移植对象配对选择的各种MHC组合的胚胎干细胞库。在这基础上,根据不同的移植对象和要求,或直接定向诱导分化为功能性细胞(如神经细胞、神经胶质细胞、软骨细胞等);或定向诱导分化为组织干细胞(如造血干细胞、神经干细胞等),这类组织干细胞也可直接取材于成体组织或器官,最终植入患者病变部位。另一种途径是将患者的体细胞核导入去核卵细胞或去核胚胎干细胞,体外发育至一定阶段后,从中分离培养出供核患者专用的胚胎干细胞,再经诱导产生所需的分化类型的细胞,回输至供核患者,同样也避免了免疫排斥问题。
组织工程(tissue engineering)与细胞工程、细胞治疗密切相关。组织工程的目的是在体外重建组织,以修复患者的缺损组织。组织工程的一般思路是:选择与人体细胞相容性较好的生物材料,按缺损组织或器官的要求设计并制成模型或支架放在体外培养系统中,使种子细胞(多用具有分化功能的组织特异型干细胞)沿着模型或支架不断地生长扩增,构建成新的组织或器官,随着细胞的不断生长、扩增,生物材料会逐渐降解而被细胞吸收,然后将初具雏形的组织或器官植入患者缺损部位。因此,胚胎干细胞和组织工程的结合,在治疗先天性器官畸形和器官移植等方面有着不可估量的应用前景。
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