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染色体G显带技术

更新:2013年12月29日 阅读次数: 【字体:
1. 实验原理 人们用物理、化学因素处理后,再用染料对染色体进行分化染色,使每条染色体上出现明暗相间,或深浅不同带纹的技术称为显带技术(banding technique)。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性,所以每一条染色体都有固定的分带模式,即称带型。染色体带型是鉴别染色体的重要依据。染色体分带技术可分为两大类,一类是产生的染色带分布在整条染色体的长度上如:G、Q和R带;另一类是局部性的显带,它只能使少数特定的区域显带,如C、T和N带。
染色体带型的形成主要取决于DNA、核酸结合蛋白及染料三者的相互作用,主要是指DNA的碱基组成以其与结合蛋白形成的特定结构对染料分子的作用。Summer(1974)的实验表明,DNA分子的螺旋及折叠非组蛋白蛋白质的分布在染色体上呈区域性差异,这些差异导致二硫键与硫氢键分布不同,深染区由许多二硫键交联,因为它易与染料结合;而浅染区则缺乏二硫键、多硫氢键,不易与染料结合而呈浅色。此外,由于染色体内DNA的碱基分布不同而造成DNA螺旋,折叠的程度也不同,继而影响到结合蛋白的分布与构型,与染料结合后呈现深浅不同的带纹。
G带即吉姆萨带,是将处于分裂中期的细胞经胰酶或碱、热、尿素等处理后,再经吉姆萨染料染色后所呈现的区带,是目前被广泛应用的一种带型。其特性是显带方法简单恒定,带型稳定,保存时间长。一般认为,易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段,在间期核呈固缩状态,而且是DNA晚复制区之一,有相当一部分中度重复序列DNA可能在G带区;相反,含GC多的染色体段则不易着色。也有人认为,Giemsa染料在G带区是与DNA结合,而且与结合DNA的染色质非组蛋白有关。总的来说,G显带的机制还未搞清。
2. 实验对象 体细胞培养后制备的染色体标本;淋巴细胞培养后制备的染色体标本。
3. 试剂与器材
(1)用具:离心管,离心机,天平,37℃温箱,载玻片,盖玻片,恒温水浴锅,光学显微镜,标本板,玻璃铅笔,定时钟,染色缸,直柄虹膜镊,滴管。
(2)药品:pH6.8 PBS,Giemsa,0.025%胰蛋白酶(取0.9%氯化钠100ml,加0.25%胰蛋白酶1ml)。
4. 实验步骤
(1)将制好的染色体标本,置72℃~75℃烤箱中烤片3h。
(2)放入预温至37℃的0.025%胰酶溶液中(pH=7.2~7.4)消化1min左右,每次的作用时间并不完全相同,可先试一张片子,再根据显带效果调整胰酶作用时间。
(3)在Giemsa 染液中染色10min,自来水冲洗干净,晾干后,即可阅片。
(4)镜检:在显微镜高倍目镜下检查显带标本,在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型,即为可取标本,可供摄像分析(图13-1)。
染色体G显带技术
5. 注意事项
(1)胰蛋白酶浓度和处理时间随气温高低有所不同。一般规律是标本存放时间越长,在胰蛋白酶当中处理时间越长。太新鲜的标本,染色体会出现毛茸现象。片龄很长的标本往往会导致斑点状的染色体。
(2)胰蛋白酶温度:温度越高,反应的速度就越快,一般是室温,但温度必须稳定至少20min。
(3)胰蛋白酶处理的时间:如果细胞呈紫蓝色,说明胰蛋白酶的作用时间不够,如果细胞呈桃红色,说明作用时间刚好。
附:
人类23对染色体的G显带记忆口诀与表13-1。
一秃二蛇三蝶飘,四像鞭炮五黑腰;
六号像个小白脸,七盖八下九苗条;
十号长臂近带好,十一低来十二高;
十三、四、五、四二一;十六长臂缢痕大;
十七长臂带脚镣,十八白头肚子饱;
十九中间一点腰,二十头重脚飘飘;
二十一好像黑葫芦瓢,二十二头上一点黑;
X染色一担挑,Y染色长臂带黑脚。
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