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几种转染方法的比较DEAE葡聚糖、磷酸钙共沉淀法、脂质体法、电穿孔法

更新:2013年12月27日 阅读次数: 【字体:
DEAE葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一,DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取,用DEAE-葡聚糖转染成功地用用于瞬时表达的研究,但用于稳定转染却不是十分可靠。
磷酸钙共沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究,先将DNA和CaCl2混合,然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀,最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上,通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.
脂质体法采用阳离子脂质转染体,具有较高的转染效率,不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系,而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA,以及RNA,和蛋白质.此外,脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达,与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物,当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质,随后DNA复合物被释放进入细胞核内.利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题.
电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系,基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内,这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞.
转染方法 原理 应用 特点
磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳转,瞬转 不适用于原代细胞,操作简便但重复性差,有些细胞不适用
阳离子
脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳转,瞬转
所有细胞
适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大
电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入 稳转,瞬转
所有细胞
适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大
DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬转 相对简便、结果可重复,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清
病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳转 可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等
逆转录病毒   特定宿主 但携带基因不能太大细胞需处分裂期,需考虑安全因素
腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染
特定宿主
可用于难转染的细胞
需考虑安全因素
Biolistic颗粒传递法 将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放表达 瞬转 可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳转,瞬转 转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高。
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