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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 重组子的筛选和鉴定实验方法

重组子的筛选和鉴定实验方法

更新:2013年09月06日 阅读次数: 【字体:

重组子可通过酶切进行鉴定,也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定,阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。

1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中,37℃摇 床培养过夜。

2. 次日取菌液 0.2-0.5ml,13,000rpm×3min 离心,弃上清,加入 20μl ddH2O 和 20μl 酚/ 氯仿,震荡混匀,13,000rpm×5min 离心。

3. 取上清进行琼脂糖电泳,加入载体质粒 DNA 作为阴性对照,根据质粒大小 初步筛选重组子,重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。

4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒 DNA。

5. 选取适当的酶,对重组子进行酶切分析,酶切体积均为 10μl 体系。酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6. 酶切分析正确的重组子分成两份,一份进行测序反应,另外一份保种。

7. 若用 PCR 法鉴定,则在第 2 步时每个样本取 0.5-1.0μl 菌液为模板进行 PCR 反应,每管反应体系最低可少至 10μl ,PCR 产物电泳,能得到所需条带的样 本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。

关键词:重组子 筛选 鉴定
相关栏目:实验技术 细胞实验
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