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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞

电转化法制备大肠杆菌感受态细胞

更新:2013年09月06日 阅读次数: 【字体:

操作步骤:

1.前夜接种受体菌(DH5α或 DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜;

2.取 2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6(约2.5-3小时);

3.将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作:

4.吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟;

5.4℃下3000g冷冻离心5分钟;

6.弃去上清,加入 1500μl冰冷的10%甘油,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

7.4℃下3000g冷冻离心5分钟

8.弃去上清,加入 750μl冰冷的10%甘油,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

9.4℃下3000g冷冻离心5分钟

10.加入 20μl冰冷10%的甘油,用移液器轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮;

11.立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。
 

影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项:

1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml );

2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行;

3.经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);

4.化合物及无机离子的影响:在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如 Mn2+或 Co2+ )、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000 倍);

5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;

6.质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ;

7.一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比。

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