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细胞工程基础实验技术

更新:2013年12月26日 阅读次数: 【字体:
1. 器皿洗涤
玻璃器皿洗涤:新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质,其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜,再用合成洗涤剂洗刷,然后用清水反复冲洗,最后用蒸馏水冲洗1~2次,干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是,先将器皿中的残渣除去,用清水洗净,再用合成洗涤剂洗刷,用清水冲洗干净,最后用蒸馏水冲洗1~2次。用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品,需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上,取出后经流水冲洗半小时左右,再用蒸馏水冲洗1~2次,然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎,洗涤时不宜用力擦洗,其洗涤方法是先用清水冲洗,然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时,取出后用清水冲洗干净,将其储藏在95%的酒精中。
塑料用品洗涤:塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤,因其附着力较强,因此冲洗时必须反复多次,最后用蒸馏水冲洗。
金属用品洗涤:金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤,需要清洗时,一般用酒精擦洗,并保持干燥。
2. 培养基配制
2.1 母液配制
为工作方便起见,常用培养基通常先按配方配制成浓度高于实际使用浓度若干倍的母液,使用时按按比例稀释即可。一般大量元素配制成10-20倍母液,微量元素和其它成分配制成100-200倍母液。常用的MS培养基母液配制见附表。配好的母液需贮存于2~4℃的冰箱中,定期检查有无沉淀和微生物污染,如果出现沉淀或微生物污染,则不能使用。
2.2 植物激素配制
植物激素一般配制成浓度为0.1~1.0mg/ml的溶液,贮存在2~4℃下备用。由于多数激素难溶于水,一般按以下方法配制。
IAA: 先用少量95%乙醇使之充分溶解,再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。
NAA: 可溶于热水中,也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D: 先用少量1N的 NaOH溶液充分溶解,然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。
细胞分裂素类: KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸,应先用少量1N的HCl溶解后再稀释至需要浓度。
赤霉素: 赤霉素的水溶液稳定性较差,一般用95%的乙醇配制成5~10mg/ml的母液低温保存,使用时再稀释。
细胞工程基础实验技术 
细胞工程基础实验技术
2.3 培养基配制
按实际配制培养基体积,取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中,加入实际配制培养基体积约2/3~3/4的蒸馏水,然后按每升所用蔗糖的量称取相应量的蔗糖(如1L培养基加20g蔗糖,若只配0.5L培养基,则称取15g蔗糖)放入培养基中使其溶化。用1N的NaOH或1N的HCl调整pH至5.8~6.0,再按0.6~0.8%的比例加入琼脂,并搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积,混合均匀后分装于培养器皿(三角瓶或试管等)或其它培养器皿中,然后进行高压灭菌。
3. 培养基及实验用具灭菌
分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间灭菌时间与培养基容量的关系见下表。如果使用人工控制的灭菌锅,必须注意灭菌温度的稳定控制,因为温度过高会引起培养基成分和pH的改变,而温度过低则会造成灭菌不彻底。灭菌后的培养基室温下最好在1~2周内用完,特殊情况可贮存于4℃下1个月左右。培养基体积与灭菌时间的关系

培养基体积(ml)

灭菌温度(℃)

灭菌时间(min.)

20-50

121

20

50-500

121

25

500-5000

125

35

 

玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致,但要适当延长灭菌时间,一般以25~30分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖,如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染,因此,器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160~180℃后恒温保持40分钟,或120℃灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥,以免引起破碎,灭菌时温度要缓慢上升,灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门,以免器皿因突然冷缩而破碎。
镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品,使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中,再以火焰将酒精烧去,待冷却后使用。也可使用一种小型电热石英砂灭菌器,代替酒精灯,每次使用完后,将用具插入消毒器的中消毒,用时取出冷却。
4. 外植体灭菌
a. 选取生长正常、无病虫危害的组织材料,除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。
b. 用70~75%的乙醇处理材料0.5~1 min.,立即除去乙醇。
c. 然后在烧杯中加入消毒剂(建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液),同时滴1~2滴土温20。,将烧杯置于摇床上振荡10~15min。如果材料污染较严重或组织较老,可适当考虑延长灭菌时间。
d. 将烧杯置于净化工作台上,弃去消毒液,用无菌水清洗3~4次,每次1min。
e. 灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。
需要注意的是,灭菌后的材料应立即接种培养,否则会造成二次感染,同时对于茎芽、花等组织材料,灭菌后若不立即接种培养,即会影响其生活力而使培养失败。从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始,操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤,否则会造成外植体污染。
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