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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 原生质体分离与体细胞杂交

原生质体分离与体细胞杂交

更新:2014年01月19日 阅读次数: 【字体:
1. 原生质体分离
1.1 实验材料: 烟草无菌苗叶片,烟草悬浮细胞系。
1.2 实验操作
a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶,置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液中,置于4℃黑暗下预处理6-8小时;
b. 用吸管吸去预处理液,然后加入用CPW盐溶液配制,经过过滤灭菌的含有2%纤维素酶、0.4%离析酶、600mmol/L甘露醇的酶溶液,用封口膜将培养皿封严,置于暗处在24~26℃下保温酶解16~18h;
c. 在倒置显微镜下观察,叶片细胞壁已降解,有圆球形原生质体释放到溶液中,即终止酶解。用吸管轻轻压挤叶片,以释放出全部原生质体;
d. 通过一个60~80μm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中,在100g下离心3min,使原生质体沉降;
e. 弃取上清夜,将沉降物缓慢加入含有CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的螺帽离心管中,在在100g下离心10min;
f. 将蔗糖溶液的顶部绿色原生质体带收集起来,并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮,在100g下离心3min,重复本相清洗过程至少3次;
g. 最后一次清洗之后,加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。
附CPW配方:

KNO3

101mg/L

MgSO4·7H2O

246mg/L

KH2PO4

27.2mg/L

KI

0.16mg/L

CuSO4·5H2O

0.025mg/L

CaCl2·2H2O

1.48mg/L


2. 原生质体密度测定
原生质体密度测定一般用血球计数板。
2.1 血球记数板的构造
记数板是1块特制的厚载玻片,上面有4条与玻片长边垂直的槽,每2个槽之间构成1个平台,故共有3个平台。其中两侧平台比中间平台高0.1mm,中间平台较宽,又有1条与玻片长边平行的短槽将其一分为二,在每一半上各刻有1个记数室,每个记数室划分为9个大方格,每个大方格面积为1mm×1mm,深度为0.1mm,盖上盖玻片后容积为1 mm3(即0.1μl或10-4ml)。中央的大方格又用双线划分为25个中方格。每个中方格又用单划线划分为16个小方格,共计400个小方格,原生质体记数即可在中央的大方格内进行。
2.2 记数方法
a. 首先在显微镜下检查记数板上的记数室是否干净,若沾有污物,须用酒精棉轻轻擦洗,用蒸馏水冲静,再用吸水纸吸干;
b. 将盖玻片盖在记数室上面;
c. 将悬浮培养基中的原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘,使它沿着盖玻片和记数板间的缝隙渗入记数室,直到充满记数室为止;
d. 记数时要使显微镜栽物台保持水平,不能倾斜。依次逐个记数中央大方格内25个中方格里的原生质体,然后根据下式求出每毫升中的原生质体数: 
1ml悬浮液中的原生质体数=1个大方格悬浮液(0.1 mm3,即0.1μl)中的原生质体数×10×1000;
e. 记数完毕后,将记数板洗净吸干。
3. PEG诱导原生质体融合的实验程序
a. 按照原生质体分离的方法,同时分离烟草叶片和悬浮细胞的原生质体;
b. 将原生质体密度调整为4E+5个/ml的原生质体悬浮液备用;
c. 在1个60×15mm的培养皿中滴1滴(2-3ml)硅液200,然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片;
d. 将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积(一般各0.5ml)混合,然后用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖玻片上。静止大约5 min,以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层;
e. 然后在原生质体悬浮液中,加入等体积的PEG溶液(50% PEG1540,10.5mmol/L CaCl2·2H2O,0.7mmol/L KH2PO4·H2O)。室温(24℃)下,将PEG溶液中的原生质体保温10-20 min.,在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况;
f. 以5 min间隔轻轻加入2滴稀释液(50mmol/L甘氨酸,50mmol/LCaCl2·2H2O,300 mmol/L葡萄糖,pH9-10.5),保持5 min后,加入1滴原生质体培养基;
g. 用新鲜的原生质体培养基,以各为5 min的间隔,将原生质体清洗5遍,每次洗完之后,不要把盖片上的培养基全部去掉,要在原生质体上留下一薄层旧培养基,而将新鲜培养基加于其上。此时可在倒置显微镜下,根据叶绿体标记统计异核融合率;
h. 洗涤完成后在盖玻片上滴大约500μl原生质体培养基,在盖玻片周围以小滴形式再加入500-1000μl培养基,以保持培养皿内的湿度,封口后置于25℃黑暗条件下培养。
相关栏目:实验技术 细胞实验
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