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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 细胞介导细胞毒作用检测法

细胞介导细胞毒作用检测法

更新:2013年08月03日 阅读次数: 【字体:
1)铕荧光检测法:
标记靶细胞:
1、EuCl3 的制备:称取58.08mg Eu2 O3 ,用少量1N HCl搅拌至溶解,再用1N NaOH调节pH至4.0。加双蒸水配成33~100mmol/L的保存液, 4℃保存备用。
2、用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106 /ml,加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖,置冰浴中20分钟,其间摇晃数次。
3、加入30μl 100mmol/L CaCl2 溶液终止反应5分钟。
4、用含2mmol/L CaCl2 的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。用含10%小牛血清 的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104 /ml。
检测方法:
1、在96孔圆底细胞培养板 中加入靶细胞悬液,每孔加100μl。
2、向各孔加100μl效应细胞,效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定,通常为5:1~20:1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液,最大释放孔中加100μl 0.5% Triton X-100。每个实验置三个复孔。
3、置 37℃ 5% CO2 的二氧化碳培养箱中培养3小时。
4、从每孔吸出20μl上清液,对应加入另一块96孔酶标板中,向第二块板每孔加200μl增强液。室温中混合5分钟。在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。同时做EuCl3 的标准曲线:用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度
5、特异性杀伤活性计算:杀伤活性(%)=[(实验组荧光强度-自然释放组荧光强度)/(最大释放组荧光强度-自然释放组荧光强度)]×100%

2)用时间分辩荧光检测法同时检测NK细胞对三种靶细胞的细胞毒性:
标记靶细胞:
1、取107 靶细胞,用洗涤液(含93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl和2mmol/L MgCl2 的50mmol/L pH7.4 Hepes,双蒸水配制)洗涤一次。小心吸去上清液,用1ml标记液(洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/L Eu3+ 或2mmol/L Sm3+ 或0.2mol/L Tb3+ ,以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA)悬浮细胞。将细胞悬液置冰上20分钟,每3分钟上下吹打1次。
2、加入2ml终止液(洗涤液中加2mmol/L CaCl2 和10mmol/L葡萄糖),终止标记反应并使细胞膜上的孔隙封闭。5分钟后用终止液洗涤3次,用细胞培养液洗涤3次,每次洗涤时离心500×g 10分钟。
3、用细胞培养液将细胞配成1.2×105 /ml或5×104 /ml备用。
NK细胞毒试验:
1、取96孔圆底细胞培养板 ,每孔加3中标记靶细胞悬液各0.033ml和0.1ml不同浓度的NK细胞,使效靶比从100:1到6:1。自发释放对照中不加效应细胞,只加0.1ml细胞培养液。最大释放对照中不加效应细胞,加0.1ml 1%Triton X-100。每种处理重复3孔。
2、在 37℃ 5% CO2 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
3、离心1 500×g 10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。每孔加200μl Delfia增强液,用下表的条件测定Eu3+ 和Sm3 的荧光强度。
 

循环时间(ms)

滞留时间(ms)

计数时间(ms)

发射波长(nm)

Eu3

1

0.4

0.4

613

Sm3

1

0.05

0.1

643

Tb3

2

0.5

1.4

545

4、用下式计算特异性杀伤活性:杀伤活性(%)=[(实验组荧光强度-自然释放组荧光强度)/(最大释放组荧光强度-自然释放组荧光强度)]×100%

3)用荧光增强配体标记的靶细胞检测CMC活性:
1、标记靶细胞:在1×106 /ml K562细胞中加入BA-TDA到10μmol/L, 37℃标记30分钟。用洗涤液(137mmol/L NaCl,4.2mmol/L NaHCO3 ,5mmol/L KCl,0.44mmol/L KH2 PO4 ,1.2mmol/L TES pH7.4)洗涤细胞5次。用细胞培养液将细胞配成5×104 /ml。
2、取96孔圆底细胞培养板,每孔加0.1ml标记靶细胞悬液和0.1ml不同浓度的NK细胞,使效靶比从100:1到6:1。自发释放对照中不加效应细胞,只加0.1ml细胞培养液;最大释放对照中不加效应细胞,加0.1ml 1% Triton X-100 。每种处理重复3孔。
3、在 37℃ 5% CO2 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、离心1500×g 10分钟。每孔取20μl上清液对应转移到另一块96孔平底细胞培养板中。第二块板每孔加180μl Eu3 溶液,摇晃5分钟后用时间分辩荧光分析仪检测荧光强度。计算杀伤活性。
关键词:介导 细胞毒 荧光
相关栏目:实验技术 细胞实验
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