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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 脂质体转染的几个实验方法

脂质体转染的几个实验方法

更新:2014年02月22日 阅读次数: 【字体:

 

实验原理
脂质 体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1:1)。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类:COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
实验步骤
1. 操作步骤(方法一):
   1) 取6孔培养板,向每孔中加入2ml含(1-2) x 105 个细胞的培养基,37℃、18% CO2 培养基40%-60%汇合时。
   2) 转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。
      A液:用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug,终量100ul。
      B液:用不含血清培养基稀释LR,使终浓度为2-50ug,终量100ul。
轻轻混合A液、B液,室温中置10-15min,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。
   3) 转染准备:用2ml不含血清培养基漂洗2次,再加入1ml不含血清培养基。
   4) 转染:把A/B复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置37℃温箱中6-24h,吸除无血清转染液,换入正常培养基继续培养。
   5) 其余处理:如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
   6) 注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二):
   1) 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。
   2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。
      a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。
      b. 旋转1s,再加入脂质体悬液,旋转。
      c. 室温下放置5-10min,使DNA结合在脂质体上。
   3) 弃去细胞中的旧液,用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去,向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物,37℃培养3-5天。
   4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24h。
   5) 吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM,2ml/孔,再培养24-48h。
   6) 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。
3. 稳定的脂质体转染法:
   1) 接种细胞同前述,细胞长至50%板底面积可用于转染。
   2) DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。
   3) 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,37℃培养48h。
   4) 吸出DMEM,用G418选择性培养基稀释细胞,使细胞生长 一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。
4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。(别的方法可以参考生产商提供的protocol)
   1) 转染前1天将0.5~2×105细胞接种于24孔培养板,并加入500ul不含抗生素 的完全培养基,以保证转染时细胞汇合达90~95%。
   2) 准备复合物
      a. 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。
      b. 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中,轻轻浑匀,室温孵育5分。注意:必须在25分内进行。
      c. 5分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育20分。
   3) 吸去培养板的培养基,用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。
   4) 将复合物(总体积100ul)加入培养孔,前后摇动培养板使其分布均匀。
   5) 将细胞放入培养箱 孵育4~6h后,可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。
   6) 24~48h后可以观察转入基因表达 情况。
   7) 稳定转染:换含血清培养基24h后将细胞以1:10(或更高比例)传代,1天后更换筛选培养基筛选。
   8) 优化:要保证细胞汇合率达90~95%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1:0.5~1:5,一般细胞1:2~3。

 

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