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中生网 > 实验技术 > 细胞实验 > 瞬时转染分析研究的步骤

瞬时转染分析研究的步骤

更新:2015年05月21日 阅读次数: 【字体:

摘要: 基因启动子的瞬时转染所经过的5个步骤:①确定需要转染的细胞系;②鉴定目的基因的假定启动子区域;③选择报告基因和相应的报告基因分析方法;④将启动子插入到合适载体的报告基因上游;⑤选择合适的转染方法.

   对基因 启动子 的瞬时 转染 分析研究必须经过下列步骤:①确定需要转染的细胞系;②鉴定目的基因的假定启动子区域;③选择 报告基因 和相应的报告基因分析方法;④将启动子插入到合适载体的报告基因上游;⑤选择合适的转染方法。

1.确定需要转染的细胞系

    用于瞬时转染分析的细胞必须具备以下条件:①细胞应表达含有目的启动子的内源基因;②必须具备将质粒 DNA 转染人细胞的方法;③能使培养物中的细胞在2―3天内保持数目恒定,以确保实验的完成。

2.鉴定目的基因的假定启动子区域

    基因组 克隆分离启动子通常是以全长cDNA的5’末端为探针筛选 基因组文库 。从基因组中分离启动子区域后,确定转录起始位点,对起始位点周围序列测序并开展功能性分析,以鉴定相关的调控元件。

3.选择报告基因和相应的报告基因分析方法

    对真核 基因调控 的了解,主要来自野生型和 突变 型的假定顺式作用调控元件的活性测定实验,这些实验是在转染的真核细胞中进行的。在大多数情况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力,而是把顺式调控元件与报告基因(reportergene)的基因序列连接起来,在基因的转录过程中,测定细胞内报告蛋白的含量或活性,来判断顺式调控元件的调控能力。虽然这是一个间接的方法,但却是一种可行,而且有时是唯一的方法。

4.将启动子插入到合适载体的报告基因的上游

    要分析启动子的活性,就要将假定的启动子序列插入到报告基因的上游。插入报告基因的DNA片段,必须首先确定翻译起始密码子和转录起始位点的位置。一般来讲,研究启动子片段下游的界限应选在转录起始位点和ATG之间。插入报告载体启动子片段的上游界限很难确定,可以参考相关文献的报道,因为特定家族的基因间可能存在相似机制。如果目的调控区是一个启动子,且置于紧靠报告基因的上游,则这种启动子就能驱动报告基因的转录。如果目的调控区是在启动子的远距离处起作用的增强子或其他调控区,通常将分析较透彻的启动子插到报告基因的上游,将增强子插到启动子的上游或报告基因的下游。下游位置通常是首选的,因为在启动子的邻近部位安置一个增强子会改变其特性,使某个元件和附近的启动子元件发生异常协同作用

附:转染技术简介

    常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如 荧光蛋白 ,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

     转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法, 脂质 体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:

 

转染方法

原理

应用

特点

磷酸钙法

磷酸钙DNA复合物吸附 细胞膜 被细胞内吞

稳定转染
瞬时性转染

不适用于原代细胞
操作简便但重复性差
有些细胞不适用

DEAE-右旋糖苷法

带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞

瞬时性转染

相对简便、结果可重复
但对细胞有一定的毒副作用
转染时需除血清

电穿孔法

高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入

稳定转染
瞬时性转染
所有细胞

适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件

病毒 介导法

通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中

稳定转染

可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等

逆转录病毒

 

特定宿主细胞

但携带基因不能太大细胞需处分裂期
需考虑安全因素

腺病毒

通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中

瞬时转染
特定宿主细胞

可用于难转染的细胞
需考虑安全因素

阳离子脂质体法

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞

稳定转染
瞬时性转染
所有细胞

适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大

Biolistic颗粒传递法

将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达

瞬时性转染

可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞, 淋巴细胞 系以及原代细胞

显微注射法

用显微操作将DNA直接注入靶细胞核

稳定转染
瞬时性转染

转染细胞数有限
多用于工程改造或 转基因 动物的胚胎细胞

     除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对 细胞毒性 小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。

    线型PEI(Line PEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高。

    GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的 纳米颗粒 ,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

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