一、试剂和材料：
1. 分化培养基：DMEM/F12（1：1）、1%ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒；V/V）、TGF-β1 1ng/ml、HEPES 10mmol/L；
2. 胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）PBSA配制；
3. PBSA：无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液；
4. 离心管，15ml；
5. 普通器皿，30ml，或圆锥底的离心管（50ml）。
二、实验方法：
1. 从培养瓶中吸出生长培养基弃之；
2. PBSA润洗后弃之洗液；
3. 加入足量的胰蛋白酶/EDTA覆盖培养瓶底；
4. 在37℃孵育5—10min（在显微镜下观察细胞是否脱落）；
5. 重悬细胞，置于15ml离心管中，300g离心5min；
6. 用1ml生长培养基洗涤，转移至普通器皿或离心管中；
7. 用血细胞计数板对细胞进行计数；
8. 重复离心（620g，10min），弃去上清液；
9. 用分化培养基将其稀释到1×106个细胞/ml；
10. 按1ml/管分装到新Eppendorf管中；
11. 300g离心5min，上清保留不动；
12. 置于37℃孵箱；
13. 每2—3天更换培养基；
14. 培养2—3周软骨生成。
