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血清学实验—玻片凝集与肥达反应

更新:2007年11月21日 阅读次数: 【字体:
【材料】
伤寒杆菌,甲、乙型副伤杆菌,痢疾杆菌诊断血清,载玻片,生理盐水等。
【方法与结果】
根据初步鉴定结果,用已知诊断血清作玻片凝集试验,如发生凝集,即可确定。如疑集阴性,应复查后再定。
(二)继续鉴定:根据需要可进一步作生化反应,血清学分型等鉴定。
【注意事项】
1. 作分离培养时宜取脓血便接种于鉴别培养基或选择培养基上。
2. 挑取可疑菌落时,每份标本可选取2~3个菌落,每个菌落接种一支双糖管。
3. 玻片凝集确定后,如果需要,可保存菌种,以便进一步鉴定和研究用。
《附录》
1、伊红美兰(简称EMB)培养基制备
1) 成份:
① pH7.6%无糖琼脂 100毫升
② 20%乳糖溶液 2毫升
③ 2%伊红水溶液 2毫升
④ 0.5%美兰水溶液 1毫升
2)制法:将上述成分混合溶化,8~10磅高压蒸气灭菌15分钟,制成平板备用。
3)应用原理:培养基中含有乳糖,伊红及美兰指示剂,伊红系酸性染料,当大肠杆菌分解乳糖产酸时,细菌带正电荷,而染上伊红,伊红与美兰结合形成紫黑色化合物,所以菌落呈出紫黑色,且有金属光泽;致病菌不分解乳糖故其菌落不变色,较透明,培养基中加入的染料还可抑制其他革兰阳性菌生长。
2、双糖铁培养的制备
1) 成分:
牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,硫代硫酸钠0.05g,硫酸亚铁0.5g,葡萄糖0.1g,乳糖1g,琼脂1g,酚红0.025g,蒸馏水100ml。
2) 制法:将上述成分(除琼脂及酚红)混合,加热溶化,矫正PH至7.4~7.6。再加入琼脂及酚红,煮沸,分装小试管内,每支约2ml,经10磅15分钟后,置成高层斜面,冷凝后即成。
3) 使用原理:克氏双糖铁培养基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁及酚红指示剂等成份。经菌分解葡萄糖产酸时,使培养基的下层由红变黄,斜面培养基中虽然也含有葡萄糖但量小,且分解产生的酸为挥发性酸,所以只发酵葡萄糖的细菌斜面仍为红色;产酸并产气时,培养基中有气泡或裂隙出现。培养基中乳糖含量大,被分解后产酸多,因此不仅培养基下层变黄,而且斜面出由红变黄,基于上述现象,通常将培养基的斜面部分代表乳糖,下层部分代表葡萄糖。培养基中含有硫酸亚铁,如有硫化氢产生,则生成黑色硫化铁,使培养基中出现黑色。
三、肥达反应
【原理】
肥达试验是一种试管凝集反应。用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原,与病人血清作定量凝集试验,以测定患者血清中无相应抗体存在,作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
【材料】
1.患者血清1:10稀释
2.伤寒杆菌O菌液、H菌液、甲、乙型副伤寒H菌液
3.生理盐水、试管、吸管、56℃水箱等
【方法】
1.取清洁小试管32支,分成4排,每排8支,依次编号。
2.于小试管内各注入0.5ml生理盐水。
3.于每一排第一管内加入1:10稀释的患者血清0.5ml,用1ml吸管吹吸三次,混匀,吸出0.5ml注入第二管作对倍稀释,……依次稀释至第7管,弃去0.5ml,第8管为对照。
4.从第8管开始,从后向前,第一排各管内注入伤寒杆菌H菌液0.5ml;第二排各管注入伤寒杆菌O菌液0.5ml;第三排各加入甲型副作寒杆菌H液0.5ml;第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H菌液0.5ml;
5.加完菌液后,振荡试管架,混匀,置于56℃水浴箱2~4小时,放冰箱过夜,或放置37℃水浴箱18小时后观察结果
肥达氏反应操作表 单位:ml
【结果与分析】
先观察对照管,正确结果应无凝集现象,再观察各试验管的凝集现象,凝集程度以“ ”多少表示之。
( )最强,上液澄清,细菌全部凝集沉淀于管底。
( )强,上液轻度混浊,细菌大部分凝集沉淀于管底。
( )弱,上液混浊,细菌少部分凝集。
(-)不凝,液体呈乳状与对照管相同。
效价判定:以能出现“ ”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。
一般认为O抗体效价在1:80以上,H抗体效价在1:160以上,有辅助诊断意义。但在分析结果时,应注意以下两点:
(1)非肠热症患者,由于曾接种过伤寒,副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒,副伤寒,以及回忆反应等原因,也可呈现阳性结果。不过,由这些原因所引起的阳性反应主要是H抗体升高,O抗体效价一般不高,同时,每隔5~7天试血一次,其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。
(2)少数肠热症患者,由于发病初期曾使用大量抗生素,或机体有免疫缺陷病,或机机反应性极弱等原因,抗体效价可以很低,甚至为阴性结果。
因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论,必须结合当地流行情况,既往接触史,以及临床症状和体征,作出正确的判断。
四、大肠杆菌肠毒素试验
产肠毒素型大肠杆菌能引起婴幼儿及旅流者腹泻,严重病例可出现霍乱样腹泻,并能造成流行。产肠毒素能力与二种可传递质粒有关,一种编码ST(耐热肠毒素)和LT(不耐热肠毒素);另一种只编码ST。由于此类大肠杆菌在形态培养和生化反应特性上与一般大肠杆菌无区别,因此,可用检测肠毒素的方法来鉴别该菌。该型菌中有产生ST菌株,也有产生ST和LT菌株,故一般分别检测ST和LT两种肠毒素。
(一)LT测定法
【原理】
LT是蛋白质,不耐热,65℃30分钟即被破坏。LT在肠道可刺激小肠上皮细胞的腺苷环化酶,使ATP转变为cAMP,促进粘膜细胞的分泌亢进,产生大量肠液,引起腹泻。由于LT对家兔小肠作用明显而又持久,故常用兔肠结扎法。
【材料】
1. 产肠毒素大肠杆菌肉汤培养滤液(含LT)、生理盐水、5%戊巴比妥钠。
2. 10周龄健康家兔、注射器、小烧杯、天平、兔固定台,解剖器械等。
【方法】
1.家兔禁食1天,仰位固定于兔台上,耳静脉缓慢注入5%戊巴比妥钠(按0.5ml/kg体重),麻醉后剖腹取出小肠,自回肠末端开始,结扎3节肠段,每段长约10cm。
2.向中间肠段注入生理盐水2ml,前、后两节肠段各注入细菌培养滤液2ml,关腹。
3.18小时后,再取出小肠,测量各节肠段的长度,并收集各段内的肠液称重,比较。
【结果】
1.注射细菌滤液段肠内液体明显增多。
2.此项试验结果可以鉴定产肠毒素型(LT)大肠杆菌。
(二)ST测定法
【原理】
ST分子量较小,无免疫原性,耐热,经100℃20分钟处理不被破坏,可以激活肠粘膜细胞上的鸟苷环化酶使胞内cGMP量增高,引起体液平衡紊乱而致腹泻。对家兔小肠作用较弱,维持时间仅6小时左右。乳鼠是ST唯一敏感动物,故常用乳鼠灌胃法,以肠重量和体重量之比来表明ST的结果。
关键词:血清学实
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