第二节 病毒感染的微生物学检查法
经典的病毒学检查方法包括病毒分离鉴定和血清学诊断（抗体的检测）。由于分子病毒学和免疫学的发展，近年来又建立了许多诊断方法，包括电镜直接观察形态、检查病毒抗原、核酸等，使得病毒感染的快速诊断成为可能（图8-3）。
图8-3 病毒感染的实验室诊断方法
一、形态学检查
电子显微镜（electromicroscopy，EM） 能观察病毒颗粒的形态和大小。对含有高浓度的病毒颗粒（≥107病毒/ml）的样品，可直接用电镜进行观察。对含量少的样品可用免疫电镜法（immunoelectromicroscopy，IEM）检查。即先将标本与特异性血清混合，使病毒颗粒凝聚，再进行电镜观察，可提高检出率，例如甲型肝炎病毒、轮状病毒感染的粪便标本、人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染者的血清标本等均可采用此法查出典型形态的病毒颗粒。
光学显微镜 能观察病毒感染细胞内的病理变化，如包涵体或多核巨细胞等。有些病毒感染细胞后，在细胞浆或胞核内会出现用光学显微镜可观察到的圆形或椭圆形的斑块，称为包涵体（inclusion body）。在多数情况下，包涵体是由大量病毒在细胞内合成堆积而形成。包涵体的位置（胞浆内或核内）和经Giemsa染色表现的嗜酸性或嗜碱性的不同对某些病毒性疾病的诊断有重要意义。如狂犬病病毒感染后可在脑神经细胞浆中检出嗜酸性包涵体，称为内基小体（Negri body），可辅助诊断狂犬病。
二、病毒的分离培养的方法
病毒的分离用于：①有新的流行发生时，如流感；②不能应用血清学诊断时；③一种临床疾病可被多种病原体引起时，例如无菌性脑膜炎可被多种病毒引起；呼吸系统疾病综合征可被多种病毒、支原体或其他病原体感染引起。
病毒必须在敏感的活细胞内增殖，所以应使用易感的活细胞对病毒进行分离培养和鉴定。其方法包括动物接种、鸡胚培养和细胞培养。
动物接种 动物接种是最原始的分离病毒的方法，但是现在已经很少用于临床实验室。目前仍然使用的是小白鼠脑内接种对狂犬病病毒或乙型脑炎病毒的分离和鉴定。
鸡胚培养 不同日龄（9～14日）的鸡胚经不同的接种途径可用于不同病毒的培养。如绒毛尿囊膜接种常用于痘病毒和单纯疱疹病毒的培养，病毒繁殖后有痘斑的形成；卵黄囊用于某些嗜神经病毒及衣原体的培养；羊膜腔接种用于流感病毒初次分离培养；尿囊腔接种常用于流感病毒和腮腺炎病毒等的培养。收获尿囊液或羊水等做血凝试验可作为含血凝素病毒生长繁殖的指标。随着细胞培养技术的成熟和广泛应用，鸡胚接种已经少用，但仍然是培养流感病毒最敏感、特异的方法。
组织培养 包括三种类型：器官培养（organ culture）、组织培养（tissue culture）和细胞培养（cell culture）。细胞培养是病毒研究、检测以及疫苗制备的一个重要技术，在病毒学发展过程中发挥了相当重要的作用。用于病毒分离培养的细胞主要有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系。
1．原代细胞培养 原代细胞是由新鲜组织（动物、鸡胚或人胚组织）制备的单层细胞，对多种病毒的敏感性高。原代恒河猴肾细胞是培养肠道病毒、正粘病毒和副粘病毒等的常用细胞。但由于制备不方便，一般只能传2～3代，故逐渐少用。
2．二倍体细胞培养 在传代过程中保持二倍体性质（46条染色体），一般能传40～50代，例如人胚肺成纤维细胞。二倍体细胞可用于多种病毒的分离和疫苗的制备。
3．传代细胞培养 传代细胞是能在体外持续传代的单细胞，由突变的二倍体细胞传代或人及动物肿瘤细胞建立的。使用和保存方便，但不能用于疫苗的生产。常用于分离病毒的传代细胞有：HeLa（子宫颈癌）细胞、Hep-2（人喉上皮癌）细胞、KB（鼻咽上皮癌）细胞和Vero（传代非洲绿猴肾）细胞等。
三、病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标
将含有病毒的标本接种在敏感的单层细胞，经过培养后，根据不同病毒的特性选择不同的鉴定方法。
细胞病变（cytopathy） 大多数病毒在敏感细胞内增殖后，会引起细胞病变，称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）（图8-4）。CPE可表现为细胞圆缩、溶解、脱落、融合、形成包涵体，甚至死亡。
图8-4 细胞病变效应
A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。?200 （李呼伦提供）
不同病毒引起细胞的病变不同，例如：副粘病毒、疱疹病毒和合胞病毒等引起细胞融合；腺病毒引起Hep-2细胞圆缩；呼吸道合胞病毒引起Hep-2细胞融合，形成多核巨细胞。因此观察细胞病变的情况是检测病毒的常用方法。根据选择的细胞类型、细胞病变的种类可对标本中感染的病毒进行判定。但是应当指出，有些病毒虽然在培养细胞中增殖，但是却不引起明显的细胞病变。
根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标是50%组织细胞感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）。该方法是将待测病毒作10倍系列稀释，分别接种细胞，经过一定时间后，观察CPE等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。用统计学方法计算出TCID50。
红细胞吸附（hemadsorption） 有些病毒在细胞内增殖的同时，病毒或其血凝素会出现于感染细胞膜上，使感染细胞能与红细胞结合，称之为红细胞吸附现象。这是检测正粘病毒和副粘病毒的间接指标。如流感病毒在感染细胞后不出现明显的细胞病变，但其血凝素会出现在感染细胞上。在细胞培养中加入红细胞后，后者会吸附在被感染的细胞上。
红细胞凝集（hemagglutination） 某些病毒感染细胞并在细胞内增殖后，从细胞内释放出来。如果这些病毒具有血凝素（hemagglutinin，HA），用细胞培养上清液与红细胞作用，则可出现红细胞凝集现象。这也是一种检测含血凝素病毒的方法。
病毒干扰作用（viral interference） 有些病毒感染细胞后，不产生明显的细胞病变，但是可干扰感染同一细胞的另一种病毒的正常增殖，称为干扰作用。此法可用于检测风疹病毒。风疹病毒在感染猴肾细胞后，不产生细胞病变，但可抑制随后接种的埃可病毒11型在细胞培养中的正常增殖。而埃可病毒单独感染猴肾细胞则可出现明显的细胞病变。
中和试验（neutralization test，NT） 将已知的抗病毒血清先与病毒悬液混合在一起，在一定温度条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞进行培养，观察病毒致细胞病变作用或红细胞吸附现象是否消失。这是比较可靠的病毒诊断方法。
空斑形成试验（plaque formation） 是测定病毒数量的一个方法。将适宜浓度的病毒接种于敏感的单层细胞培养中，经一定时间的培养后，在其上方覆盖一层融化的琼脂。继续培养后，单个病毒的复制增殖使局部的单层细胞脱落，形成肉眼可见的空斑（plaque），经染色后更加明显。一个空斑是一个病毒大量复制而成。因此，可通过计算空斑数推算出该样品中病毒的含量。通常以每毫升病毒悬液的空斑形成单位表示（pfu/ml）。该技术可以用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用。
四、病毒成分的检测
病毒抗原的检测 一般采用免疫学技术进行病毒抗原的检测，用已知的病毒特异性抗体来检测可疑标本是否含有病毒的抗原。例如：检测HIV和HBV抗原。此类技术操作简便、特异性强、敏感性高、待检样品中不必有完整的病毒体存在，可以节省分离鉴定病毒的时间和繁杂的实验步骤，特别是对于一些血清型别有限的、难以用常规细胞培养技术培养的病毒，更是一个快速而实用的方法。只要具有较高质量的特异性抗体，标本中存在一定量的病毒抗原，可在几小时到1天的时间内完成其检测。经常使用的诊断试剂是单克隆抗体，目前常用的技术是荧光标记技术、酶标记技术（如enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或放射免疫标记技术。其中ELISA一般用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物，聚苯乙烯微孔板、试管、有机小球等作为固相支持物，试验通过颜色的改变反映标本中是否存在病毒抗原或其量的多少。本实验方法操作简便、价格便宜、比免疫荧光技术敏感，没有放射性污染，因而是最为广泛被应用的一个实验室方法。
病毒核酸的检测 随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的病毒基因已被成功地克隆并确定了其核苷酸序列，为通过检测病毒的核酸来对病毒感染性疾病进行临床实验室诊断奠定了良好的基础。
同细菌的核酸诊断技术类似，病毒核酸诊断技术也主要是核酸分子杂交和PCR技术。斑点杂交可用于大多数病毒核酸和PCR产物的检测。原位杂交主要用于细胞内病毒的检测和定位。目前常使用原位杂交技术对人乳头瘤病毒进行检测与分型。Southern印迹法和Northern印迹法可分别用于病毒基因组DNA或RNA的检测。
PCR技术已经广泛用于病毒学研究和病毒感染性疾病的诊断。大多数常见的病毒均有应用PCR技术进行检测的报道。自从PCR技术建立以来，多种不同的PCR技术已经用于病毒的检测。RNA病毒的检测应选择逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）的方法，先将病毒mRNA反转录为cDNA，再行PCR扩增。原位PCR用于对病毒在细胞内的定位检测，敏感度可达到10个拷贝/细胞。最近出现的实时PCR技术可以检测基因的拷贝数。
基因芯片（gene chip），又称DNA芯片（DNA chip）或cDNA微矩阵列（cDNA Microarray），是根据标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交的原理，利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针，形成DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。因此基因芯片技术在感染性疾病的诊断和流行病学的调查中将会发挥重要作用，这一技术将会有力地推动临床实验室检测水平向前发展。另外，用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。对临床用药和新药物的合成均具有指导作用。
五、病毒抗体的检测
用已知病毒抗原检测病人血清中有无相应抗体是病毒实验室检查的主要方法手段，也称为病毒的血清学诊断。如前所述，这类技术需要采集病人在急性期和恢复期的双份血清，比较血清效价是否有明显升高。病毒特异性IgG类抗体将恢复期与早期对比，升高4倍或4倍以上方具有诊断意义。因只有单份血清IgG效价的升高不能区分出既往感染或正在感染，很难作为一个辅助诊断的指标。该法不能用于快速诊断。由于抗病毒特异性IgM出现早，消失快，因此在某些病毒性疾病，特异性IgM的出现或升高则表示病毒感染的早期，例如，HBV核心抗原的特异性IgM的出现提示HBV感染的早期。多种免疫学实验方法可用于病毒抗体的检测，包括中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验等经典方法，也包括ELISA和蛋白印迹等技术。
中和试验（neutralization test，NT） 病毒在体内或细胞培养中可被特异性抗体中和而失去感染性，根据特异性血清能保护细胞（或鸡胚、动物）不出现病变的稀释倍数判定抗体效价。常用于人群免疫状况调查，临床诊断较少使用。
血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test，HI） 有些病毒（如流感病毒）表面有血凝素（HA），能凝集脊椎动物（如鸡、豚鼠和人等）的红细胞，称为血凝现象。但当病毒与其HA特异性抗体作用后，可以阻止病毒表面的HA与红细胞的结合，称为血凝抑制试验。本法可用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等有HA的病毒的血清学诊断和流行病学调查，也可用于鉴定病毒的型或亚型。
补体结合试验（complement fixation test，CF） 是用已知病毒可溶性抗原检查患者血清中相应抗体，即CF抗体。CF抗体常于病毒感染数日后出现，故可作为近期感染指标。但由于方法繁琐、型特异性较低，临床不常采用。
ELISA法 由于该法具有特异性高、敏感性强、操作方便等优点，目前已经广泛应用于细菌、病毒和其他病原体的临床化验室检测，特别是在病毒感染性疾病的诊断中常用。已经有多种病毒的商品化检测试剂盒，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、各型肝炎病毒、EB病毒和HIV等的诊断。
蛋白印迹技术（Western blot） 是将SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳的高分辨力与酶免疫技术的特异性和敏感性相结合的方法。由于病毒蛋白的分子量和所带电荷不同，在SDS-PAGE上会得到不同的蛋白条带。将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，进行抗原抗体反应，最后用显色剂（如化学发光物质）显示与相应抗原结合的特异性抗体。本试验是用已经病毒蛋白检测未知病毒特异性抗体的方法。目前WHO规定该试验作为HIV感染的确认试验，现广泛被应用。
