了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理
原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种 工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点
(1)、 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤
(1)、 选择亲本 选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、 制备原生质体 经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、 促融合 聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、 原生质体再生 原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、 检出融合子 利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、 融合子筛选 产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
(三)、 原生质体再生率和融合率计算
三、实验材料
(一)、 菌种：
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二)、 培养基(配制方法见下一页附录)：
(1)、 完全培养基(CM，液体)；
(2)、 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；
(3)、 基本培养基(MM)；
(4)、 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；
(5)、 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。
(6)、 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。
(三)、 缓冲液：
(1)、 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2)、 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四)、 原生质体稳定液(SMM)：
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五)、 促融合剂：
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六)、 溶菌酶液：
酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。
(七)、器皿：
养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器。
四、实验步骤
(一)、 原生质体的制备：
1、培养枯草芽孢杆菌：
取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。
2、收集细胞：
各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。
3、总菌数测定：
各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。
4、脱壁：
二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。
5、剩余菌数测定：
取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数
(二)、 原生质体再生：
用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5 mL 原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48 h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。
(三)、 原生质体融合：
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。
(四)、 检出融合子：
取0.5 mL 融合液，用SMM 液作适当稀释，取0.1 mL 菌液与灭菌并冷却至50℃的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，36℃培养2 d，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。
(五)、 融合子的筛选：
挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合 子。由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种只发生质配，而无核配，形成异核体。两者都能在再生基本 培养基平板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定。故在传代中将会分离为亲本类型。所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和选择。
