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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 禽霍乱禽巴氏杆菌病诊断技术

禽霍乱禽巴氏杆菌病诊断技术

更新:2014年01月19日 阅读次数: 【字体:
1.本次实验的目的和要求
(1)观察家禽巴氏杆菌病的临诊表现和病理解剖变化
   (2)掌握禽巴氏杆菌病的微生物学诊断方法
2.实验内容或原理
根据典型症状和病变,以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌,可初步诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定,病原分离鉴定原理为革兰氏染色法。
3.需用的仪器或试剂等
动物:鸡、小白鼠
器材:外科镊子、外科剪、灭菌纱布、载玻片、糖发酵管等。
药品:草酸铵结晶紫、革兰氏碘、碳酸复红、瑞特氏染液、美蓝染液、棉拭子、接种环、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M—肌醇、水杨苷。胰蛋白酶、L-胱胺酸、琼脂粉、酚红。
4.实验步骤
一、临床症状和病理变化
⒈ 症状
(1)急性症状:描述
    (2)慢性症状:描述
⒉ 病理变化:描述
、微生物学诊断
⒈ 抹片的制备
    用镊子夹持病变组织肝或脾,然后以灭菌剪刀剪取小块,夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层;若取血液,用灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块,用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层。自然干燥。将干燥好的抹片,涂抹面向上,以其背面在酒精火焰上来回通过数次,略作加热进行固定。
⒉ 革兰氏染色法
    固定好的抹片上滴加草酸铵结晶紫色液,染色2min→水洗+加革兰氏碘溶液于抹片上媒染2min→水洗→加95%酒精于抹片上脱色1min→水洗→加稀释碳酸复红复染30s→水洗→吸干→镜检。巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌,单个或成对存在,常有荚膜。
⒊ 其他染色法
    甲醇固定,瑞特氏或美蓝染色呈两极浓染的菌体。
⒋ 病原分离
(1)病料的采集:最急性和急性病例可采集死亡禽只的肝、脾、心血;慢性病例一般采集局部病灶组织;对不新鲜或已被污染的样品,可自骨髓中采取病料。采病料时用烧红的刀片烧烙组织,而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心血内取样。如果为活禽,可通过鼻孔挤出粘液,或将棉拭子插入鼻裂中取样。
(2)培养基制备:马丁琼脂培养基(本实验中采用该培养基)、5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基。
(3)动物接种:如果病料污染严重,则可将0.2mL碾碎的病料,经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡,接种动物在24h~48h内死亡,可以从肝脏、心血中分离到巴氏杆菌。
(4)培养:将病料接种于马丁琼脂培养基在35℃~37℃下培养,经18h~24h培养后菌落直径为1mm~3mm,菌落呈散在、圆形,表面凸起呈奶滴状。
注意:如果病料未污染,(3)、(4)步骤可省略。
⒌ 病原鉴定
(1)培养特性:为兼性厌气菌,生长最适温度为35℃~37℃,经18h~24h培养后,菌落直径为l mm~3mm,呈散在的圆形凸起和奶油状,有荚膜菌落稍大。
(2)镜检:从菌落上挑取少量涂片,干燥,固定、染色、镜检同上。
(3)生化鉴定:
1.糖发酵试验:取纯培养物分别接种葡萄糖、单奶糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖发酵管,37℃培养2~3d,观察结果。
  2.吲哚试验:取纯培养物接种蛋白胨水,37℃培养2~3d,加入吲哚试剂,观察结果。
  3.硫化氢试验:取纯培养物接种醋酸铅琼脂,37℃培养18~24h,观察结果。
  4.对紫乳作用的观察:取纯培养物接种紫乳培养基,37℃培养2~3d,观察结果。
巴氏杆菌生化试验
细菌名称 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 单奶糖 鼠李糖 吲哚试验 H2S试验 紫乳作用 动力
巴氏杆菌 + - - + + + - + + - -
注: + 糖发酵试验中表示产酸不产气、其它试验中表示阳性; - 阴性。
⒍ 动物试验
  1.取病料制成1:10乳剂,或用细菌的培养液。
  2.取0.2~0.5ml皮下注射小白鼠,经24~48h动物死亡。置解剖盘内剖检观察其败血症变化,同时取心血、肝、脾组织涂片,分别进行美蓝染色或瑞氏染色、革兰氏染色,镜检可见大量两极浓染球杆状的巴氏杆菌,革兰氏染色阴性。
7. 结果判定:
依据病原分离培养特性、生化鉴定、动物接种试验可作出确切诊断。
5.教学方式
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