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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 病毒学研究方法和手段的进展

病毒学研究方法和手段的进展

更新:2013年12月29日 阅读次数: 【字体:
病毒学的研究初期,由于当时人们在显微镜下观察不到病毒粒体,加之病毒又不能进行人工培养,因而分离到病毒对于明确病毒的生物学特性显得十分重要。在当时 尚无高速离心机的情况下,人们试图用马力离心机来从病组织中分离病毒。直到高速和超速离心机问世后,人们才有可能依据病毒学性分离和制备病毒。时至今日, 病毒的分离,用专业术语来说即病毒的提纯,在病毒学的分子生物学研究中仍然是关键步骤。

  1953年,斯坦利第一次提取并结晶了 TMV,这是病毒学史上一个重要的里程碑。以后,人们先后从不同的组织中分离到了病毒。病毒的提纯是将寄主中的病毒粒子与寄主细胞组分区分开来的过程。其 原理是利用病毒的蛋白质和大分子粒体的特性,及其与寄主细胞组分在理化特性上的差异将病毒粒子区分出来,并尽可能保持侵染力。提纯病毒的目的是确切地研究 病毒理化、生物学特性、化学组分、组成、增殖过程及机制,还可用于制备高效价的抗血清。以植物病毒为例,人门先是把在植株中含量高、体外稳定的病毒,如 TMV、马铃薯X病毒等提纯出来。目前,越来越多的技术和程序能用以提纯浓度和稳定性不相同的病毒,为病毒的研究工作奠定了基础。

  电子显微镜始终是研究病毒的不可或缺的工具,1960年以后将样品用重金属盐类溶液作负染,更能详细研究病毒的结构,使对病毒的认识大大地推进一步。对那些在细胞培养中不能生长的病毒,电镜术更是一种重要的诊断手段。

  细胞培养对病毒学的研究起了很大的推动作用,最早用于脊髓灰质炎病毒的培养,此后广泛用于人医和兽医上各种病毒的分离和培养。Dulbecco(1952)发明了空斑技术,使病毒的定量检测和克隆成为可能。

   生物化学和分子生物学的发展对病毒学的研究提供了有力的武器。例如X射线晶体衍射、原二色性和核磁共振技术用于研究病毒的三维结构;聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)用于病毒核酸及多肽成分的分析。应用生化技术,鉴定了病毒的核酸聚合酶,特别是反录酶,它不但在理论上而且在实用上都有重大意义。核酸杂交技 术为病毒鉴定和诊断提供了敏感而可靠的手段。DNA重组技术和人工合成多肽为研制新型疫苗开辟了崭新的途径。目前,免疫荧光技术是研究病毒侵染过程、定位 及其病毒基因功能的重要手段。

  中国学者对病毒学的发展作出过贡献。汤飞凡1925年在美国对疱疹病毒进行过研究,他和他的导师Zinsser用物理学方法研究病毒的本质,证明病毒是存在于宿主细胞内能自我复制的颗粒,为病毒学的创立做出过重要贡献。

   由于病毒是微生物中最小的生物,在普通显微镜下观察不到。在20世纪初要检测病毒的存在,必须通过注射感染,观察动物发病或死亡情况来判断。显然这种检 测方法是十分原始的。由于病毒没有自己的酶系统,靠寄生在活细胞内生存,在一般的微生物培养基上不能繁殖,这就给寻找培养病毒新技术增加了难度。然而,病 毒培养是病毒研究中最基础、最关键的一步,可以说没有病毒培养新技术的建立,也就没有病毒研究的突破和发展。许多国家为此投入了大量的人力和物力,国际上 许多知名学者为此苦苦思索了几十年。1943年,黄祯祥在美国发表了对病毒学研究有重大影响的论文“西方马脑炎病毒在组织培养上滴定和中和作用的进一步研 究”。这一研究成果,使病毒在试管内繁殖成为现实,从此摆脱了人工繁殖病毒靠动物、鸡胚培养的原始落后的方法。这一新技术可以概括为:第一步,用人为的方 法将动物组织处理消化成单层细胞,并给以一定的营养成分使其在试管内存活;第二步,将病毒接种在细胞内,经过一段时间细胞就会出现一系列病理改变。观察者 只要用普通显微镜观察细胞有无病理改变,即可间接观测和判断有无病毒繁殖。这一新技术把病毒培养从实验动物和鸡胚的动物水平.提高到体外组织培养的细胞水 平。

也正是这项新技术拓宽了国际上病毒学学者的思路。许多病毒学家采用或改良这一技术,成功地发现了许多病毒性疾病的病原,分离出许多新病毒,解决了当时还鲜 为人知的一些疾病的病毒病因问题。有些学者还采用组织培养技术制备了疫苗,实现了人群的主动免疫,为控制和消灭病毒病做出了贡献。50年代美国著名病毒学 家恩德斯(Enders)获得诺贝尔奖,就是在采用黄祯祥这一技术的基础上取得的成果。美国1982-1985年出版的《世界名人录》称这一技术为现代病 毒学奠定了基础。世界上许多国家采用这种技术分离了诸如流行性出血热、麻疹、小儿麻痹病毒。近年来在全球引起震动的艾滋病病毒也是采用组织培养这一技术分 离到的。

 朱既明1948年在英国发现同一病毒可因变异而呈不同形态,并首次将流感病毒裂解为有生物活性的亚单位,并在此基础上提出 了病毒的结构模型,这一假说为后来阐明各种病毒结构开创了先河,并为研究亚单位疫苗准备了理论和方法的基础。朱既明还发现了正常血清中抑制流感病毒血凝作 用的β-抑制素。高尚荫1943年在美国进行烟草花叶病毒研究时曾观察到病毒感染不同宿主后仍保持稳定理化和血清学特征,在病毒学发展史中有一定地位。
关键词:病毒学手段
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