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微生物菌种的保藏

更新:2013年12月29日 阅读次数: 【字体:

目的
1、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目标微生物。
2、学习并掌握几种常用的微生物菌种保藏方法。
原理
保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身,而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变,同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此,选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法事关重要。
由于微生物种类繁多,且保存方法的难易程度不同,所以微生物菌种的保藏方法亦有许多。但是不管有多少种菌种保藏方法,其基本原理都要求使微生物的代谢作用降至最低程度,从而使其处于不活泼的状态,即休眠状态。就微生物本身而言,保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行;而从环境条件来说,就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条件。以下将对几种微生物菌种的保藏方法加以简单介绍。
1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时,会很快死亡,因此在这种情况下,只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时,培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地,大多数菌种的保藏温度以5℃为好,像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存,而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便,但其缺点也很明显,如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时,菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种,工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥,并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种,如
① 土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液,立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥,然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜,土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是:取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中,加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜),然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种,培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止,移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封,冷藏或室温保存。
② 砂土保存法:取清洁的砂,过60目筛去掉大砂粒,并用磁铁吸去砂中铁屑,再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗数次,干燥后,置于试管或安瓶管中保持2~3cm深,再经干热灭菌后,加入1ml菌种培养液,经充分混匀后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌,再进行菌种保藏。
③ 硅胶保存法:以6~16目的无色硅胶代替砂子,干热灭菌后,加入菌液。加菌液时,由于硅胶的吸附热常使温度升高,因而需设法加以冷却。
④ 磁珠保存法:将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4),上铺玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间。
⑤ 麸皮保存法:在麸皮内加入60%的水,经灭菌后接种培养,最后干燥保藏。
⑥ 纸片(滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中,常压或减压干燥后,置于装有干燥剂的容器内进行保存。
4、悬液保存法:即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有,
① 蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。
② 糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷冻保存法:适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤,而对其它大多数微生物而言,无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结,都会对菌体造成损伤,因此当采用这种保藏方法时,应注意以下几点,
① 要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞;
② 要选择适宜的培养基,因为某些微生物对冷冻的抵抗力,常随培养基成分的变化而显示出巨大差异;
③ 要选择合适的菌液浓度,通常菌液浓度越高,生存率越高,保存期也越长;
④ 最好在菌液内不添加电解质(如食盐等);
⑤ 可在菌液内添加甘油等保护剂,以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样,也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂,但对有些微生物而言,不加保护剂时更有效。
⑥ 原则上应尽快进行冷冻处理,但当加入保护剂时,可静置一段时间后再进行处理。
⑦ 就动物细胞而言,应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温,此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言,则不必如此,如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温,而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻;
⑧ 若进行长期保存,则贮藏温度越低越好;
⑨ 取用冷冻保存的菌种时,应采取速融措施,即在35~40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说,则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后,应尽量避免再次冷冻,否则菌体的存活率将显著下降。


常用的冷冻保存法包括:
① 低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。
② 干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。
③ 液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下,
a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中,将0.2~1ml的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。
b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时,则不需熔封。
c、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2~30分钟后,观察有无色素进入安瓶。
d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却30~60min。
e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。
7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水
分。事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存,其过程如图6-1所示。
在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题:
a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到109~1010/ml。
b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。
c、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水刷净,干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥。
d、添加保护剂:常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、Bordelli氏法:取干净的小试管(8×60mm)塞上棉塞,灭菌。用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔,制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴,然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名。将小试管装在15×150mm的试管中,在大试管底部事先装上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧,蜡封。将大试管与真空泵连通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱时,将玻璃管熔封,置室温暗处或冰箱保存。
仪器与材料
1、斜面菌种:丝状真菌、酵母菌、芽孢杆菌和无芽孢杆菌各一支。
2、接种用具一套。
3、灭菌物品:1ml、5ml吸管,长滴管,安瓶管,9ml无菌水试管,砂土管,液体石蜡,脱脂牛乳。其中,液体石蜡的处理为1.5kg/cm2压力灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌3次,每次30分钟。接着检查是否彻底无菌,即接入肉汤中检查有无杂菌生长。最后放在60~80℃轰烤以去除水分。脱脂牛乳的处理为2000rpm离心10分钟脱脂,然后0.5kg/cm2压力灭菌20分钟,或间歇灭菌3次,经检查无菌后备用。
4、P2O5,无水CaCl2各一瓶。
5、真空干燥器,真空泵。
方法
1、液体石蜡覆盖法:取待保存的菌种斜面,用5ml无菌吸管向内加入灭菌石蜡,要求液体石蜡高出菌斜面1cm左右,若不够此高度,则常会引起斜面抽干现象。
2、砂土管法:用1ml无菌吸管吸取0.2~0.5ml菌悬液,滴入砂土管中,充分混匀后,将砂土管放入真空干燥器内,抽干,真空干燥器内需放置无水CaCl2。最后,将干燥好的砂土管取出,迅速于火焰上蜡封管口,并在室温下或冰箱中进行保存。
3、冷冻干燥保藏法:

① 用灭菌长滴管取出2滴(约0.1ml)无菌脱脂牛乳,置于无菌安瓶管中,然后用另一支无菌滴管取出等体积的浓菌液,同样置于此安瓶管中,充分混匀。

② 集中安瓶管,置于100ml烧杯中,将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内,开机并开冷却水后,使菌液在-20℃温度下迅速冻结成固体,然后抽真空使水分升华,2小时后,可以停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥,直至全干为止。

③ 最后取出安瓶管,并将其与真空泵连接,再抽真空后,迅速将安瓶管熔封,最后冰箱保存。
4、甘油管保藏法:在5ml菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后,于-20℃冰箱中保存。
关键词:淀粉质 酒精发酵
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