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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存

大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存

更新:2013年12月29日 阅读次数: 【字体:
大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌,它的遗传背景研究的比较详细,常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一.  实验目的: 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。

二.  实验原理: 大肠杆菌除本身的核染色体外,往往还含有质粒(Plasmid)DNA,这是一种双链闭合环状的DNA分子,大小在1Kb-200Kb左右,通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因,而使寄主菌表现以下一些表现型:

 1.对抗生素的抗性      2.产生抗生素           3.降解有机复合物

 4.产生大肠杆菌素      5.产生内毒素           6.产生限制修饰酶

  pUC19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因,它能编码一种β-内酰胺酶,这种酶降解氨苄青霉素,从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用,不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。

三.实验材料: E.coli InvaF'    E.coli InvaF'(pUC19)

四.实验仪器、器皿及试剂:

  仪器:超净工作台   恒温培养箱    高压灭菌锅     恒温水浴锅    微波炉等

  器皿:(见附录)

  试剂:琼脂    酵母抽提物    胰蛋白胨    Nacl   氨苄青霉素    NaOH等

五.实验步骤:

1.      配制培养基:

a.LB(Lurib-Bertani) media

酵母抽提物   (Yeast extract)    5g/L

胰蛋白胨     (trytone)        10g/L

        Nacl                        10g/L

加蒸馏水定容至1000ml调节pH值至7.0。

配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中,按15 g/L加入琼脂加热至充分熔化,即成固体培养基。

b:50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH2O至100ml。

将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min

2.      倒平板:将固体培养基加热至充分熔化,待温度降至50℃以下凝固前,加入Amp至100ug/ml摇动混匀,每平皿倒入25ml左右,此过程应进行无菌操作,另倒一不含Amp的LB平板。

3.      待培养基凝固以后,用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coli InvaF'  和  E.coli InvaF'(pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,划线接种要防止划破培养基,划线方法如图所示:

大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存

第一次划线后接种环灼烧   第二次划线起点与第一次        如此在平板上

再进行第二次划线         划线交*,接种环灼烧后再        划线5-6次

                      进行第三次划线

4.      接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜,运用这种划线方法接种,可以较好地保证单菌落的形成。

5.      比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF'E.coli InvaF'(pUC19)的单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。

6.      分别吸取0.5 ml菌液在无菌条件下,加入0.5 ml 50%丙三醇,置一灭菌的冻干管中,混匀至-20℃保存。

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