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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 毕赤酵母表达的培养基配制大全

毕赤酵母表达的培养基配制大全

更新:2014年04月27日 阅读次数: 【字体:
 

毕赤酵母表达的培养基配制

2.1 LB(Luria-Bertani)培养基:

Trypton l%

Yeast Extract 0.5%

NaCl l%

PH 7.0

制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

2.2 LLB(Low Salt LB)培养基:

Trypton l%

Yeast Extract 0.5%

NaCl 0.5%

PH 7.0

制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时,加入Zeocin 25ug / ml,可以4℃条件下保存1~2周。

2.3 YPD (又称YEPD)

Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)

Trypton 2%

dextrose (glucose) 2%

+agar 2%

+Zeocin 100 μg/ml

液体YPD培养基可常温保存;琼脂 YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml,成为YPDZ培养基,可以4℃条件下保存1~2周。

2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium):

yeast extract 1%

peptone 2%

dextrose (glucose) 2%

sorbitol (山梨醇)1 M

+agar 2%

+ Zeocin 100 μg/ml

不管是液体 YPDS培养基,还是YPDS + Zeocin 培养基,都必须存放4℃条件下,有效期1~2周。

2.5 MGY

Minimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)

(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。将800ml灭菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可,4℃保存,保存期为2个月。

2.6 MGYH

Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸)

在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀,4℃保存,保存期为2个月。

2.7 RD

Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基)

(含有:1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸)

1. 将186g的山梨醇定容至700ml,高压灭菌;

2. 冷却后于45℃水浴;

3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤2 的山梨醇溶液混合。4℃保存。

2.8 RDH

Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸)

在RD培养基配制的第三步中,在加入10ml的100*H母液,同时无菌水的体积减少至78ml即可,其余配制方法与RD相同。4℃保存。

2.9 RD及RDH平板的制备

1. 将186g的山梨醇和15-20g琼脂 粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;

2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂 液混匀;

3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。

2.10 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备(常用于酵母菌的包被)

1.将186g的山梨醇和 7.5~10g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;

2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、 100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀,预热至 45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀;

3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温,备用。

2.11 MD与MDH

Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培养基 +( 0.004 %组氨酸)

(含有:1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖)

1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液,用800ml的无菌水定容至1000ml即可;

2. 如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;

3. 如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。

2.12 SOC培养基:

Trypton l%

Yeast Extract 0.5%

NaCl 0.05%

Glucose (1mol / L) 2%

121℃高压灭菌 20min,冷却后,4℃保存

2.13 MM培养基:

M9母液:64g磷酸氢二钠,15g磷酸二氢钾,2.5g氯化钠,5.0g氯化铵加1L水灭菌

取M9母液200ml加水700ml,加2ml1mol/l已灭菌的硫酸镁,加100微升已灭菌的1mol/l氯化钙(可加可不加)。注意硫酸镁和M9母液要分开灭菌不然会有沉淀。在M9培养基基础上添加0.5%葡萄糖即为MM培养基。

2.14 BMGY /BMMY培养基:

酵母粉:1.0克,蛋白胨:2.0克,YNB:1.34克,0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液,甘油:1.0毫升,加蒸馏水到100mL

2.15 BMM培养基,全称:Buffered minimal methanol 即最小缓冲甲醇培养基,常用于表达分泌型蛋白的培养基。

配制:

100mM pH6.0磷酸钾 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇

1. 灭菌700ml 水,

2. 冷至室温,加入下列:100ml 1M pH6.0磷酸钾缓冲液, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M

3. 放置于4 度,可放2 个月

10×YNB (13.4%酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸)

溶解134gYNB于1000ml水中,过滤除菌,加热至YNB 完全溶解,存于4 度。或者用34gYNB(不含硫酸铵不含氨基酸),100g 硫酸铵进行配制,可放1年。注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好。

YPD:最基本的培养用;BMGY:诱导表达前培养用;BMMY:诱导表达用;MD:电转化后筛选his+用。

YEPD是不能代替BMGY的,因为有葡萄糖,这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的,就是用YPG培养基代替,只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替,也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比,甘油残余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇,在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。

YNB可以高压灭菌,没问题的,也可以0.22um过滤处理,天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入;配YPD时可以加入YPD一起灭菌,但时间不能太长,温度不能太高,一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长,温度过高,可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应,这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话,基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。

小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除,培养基价格便宜,操作又方便,可以直接灭菌,效果也很好(效果不比含YNB的差)。

如果是用自己配置的培养基,如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等,可以不用换液,采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。

用无机盐进行大规模发酵,更省钱。

大规模发酵时,甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵,在武汉买个钢瓶600元左右,一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3-4瓶氧气。

关于Tryptone和Peptone的选择:

1)用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母,根本就长不好.

2)Tryptone和Peptone虽然都是营养胨,但营养成分不一样.即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长,生长状态也没有在Peptone中好.但tryptone和peptone就是含量上有点不同外,其他没什么区别,用peptone的目的不是为了提供氮源,提供氮源的是培养基里面的YNB。

3)如果要求不高,一般使用也还凑合.尽可能的用Peptone,difco公司的,晶美公司代理的,甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌.

4)用含Peptone的培养基颜色很深,纯化表达蛋白时颜色要去掉,所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后,培养基颜色变得很浅,和LB(液体)颜色差不多,后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解,加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解,因为peptone是一些小的短肽,是一些酶作用的底物。

培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。

配制500×BIOTIN stock solution(0.02%)有这么3种方案:

1)、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中,放过夜,基本就能溶;

2)、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH,就很容易溶解了;

3)、水浴加热,温度不能高于50度。

D-生物素是具有生物活性的生物素,也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中,作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加,因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素,但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基,没有哪种成分会含有微量生长因子(如生物素)。所以肯定要加的。

附:无机培养基配方

BSM无机培养基:

85% H3PO4 26.7ml/L

CaSO4 2H2O 0.93g/L

K2SO4 18.2g/L

MgSO4 2H2O 14.9g/L

KOH 4.13g/L

甘油 40g/L

PMT1 4.0ml/L

100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0,氨水用于上罐调pH(便宜,方便)。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀,pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。

BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1,用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。

PMT1(1L)配方:

CuSO4 5H2O 6.0g/L

KI 0.088g/L

MnSO4 H2O 3.0g/L

Na2MoO4 2H2O 0.2g/L

H3BO3 0.02g/L

CoCl2 6H2O 0.5g/L

ZnCl2 20.0g/L

FeSO4 7H2O 65.0g/L

Biotin 0.2g/L

浓H2SO4 5.0ml

 

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