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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 病毒的大规模纯化技术

病毒的大规模纯化技术

更新:2013年12月29日 阅读次数: 【字体:

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子,以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒(Polio virus)的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。

在开展人体病毒实验工作以前,让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得,大多数工作人员可能已经获得免疫,但重新免疫是必要的预防措施。

病毒的纯化步骤主要是:1.在大规模的装置中培养病毒;2.去除富含病毒培养液;3.通过沉淀将病毒浓缩;4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。

1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒,必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的,可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上,也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下,每个宿主细胞能生产10~1000的感染单位的病毒,即每毫升一个感染单位的滴度(或称效价)。

2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候,培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放,要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。

3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的,它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl(每毫升培养液中加0.4g)沉淀下来。这一过程要在低温下进行,NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降,溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心(2000g,1-2hr)。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍,99%以上的病毒粒子可沉淀回收。

4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。在后者中,病毒在离心试管中成为一个分离带,这一过程与对DNA的分离相同,离心须要高速,即120000g,且要进行好几个小时,最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来,要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下,所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中,所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒,就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料,且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。 本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。

关键词:病毒 大规模纯化
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