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中生网 > 实验技术 > 微生物实验 > 细菌的生化鉴定法

细菌的生化鉴定法

更新:2015年04月30日 阅读次数: 【字体:

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物特性,这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统,故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同,它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同,利用这种特点建立细菌生化反应,在菌株的分类鉴定中具有主要意义。

【实验目的】

1. 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理。

2. 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。

【实验原理】

各种细菌由于具有不同的酶系统,致使它们能利用不同的底物,或虽然可以利用相同的底物,却产生不同的代谢产物,因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。

【试剂与器材】

1. 菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种

2. 培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)

3. 试剂 40%NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。

4. 器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。

5. 流程 糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验。

【实验方法与步骤】

1. 糖发酵实验

① 试管标记 取分别装有不同糖类(如葡萄糖、蔗糖和乳糖等)发酵培养液的试管,根据需要培养的细菌做好标记(如大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照)。

② 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中,空白对照中不接种,置37℃恒温箱中培养,分别在培养24h、48h和72h观察结果。

③ 观察记录 培养后各发酵管与空白对照相比,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该种糖,记录用“-”表示;如培养液呈黄色,反应结果为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸,记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应,表明该菌分解糖能产酸并产气,记录用“+”表示;如杜氏小管内没有气泡为阴性反应,记录用“-”表示。

2. V.P.试验

① 标记试管 取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管,根据需要将培养的细菌做好标记。

② 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中,空白对照管不接种,置37℃恒温箱中,培养24~48h。

③ 观察记录 取出以上试管,振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名,分别加入3~5ml以上对应管中的培养液,再加入40%NaOH溶液10~20滴,并加入约0.5~1mg微量肌酸,振荡试管,以使空气中的氧溶入,置37℃恒温箱中保温15~30min后,若培养液呈红色,记录为V.P.试验阳性反应(用“+”表示);若不呈红色,记录为V.P.试验阴性反应(用“-”表示)。

注:原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

3. 甲基红试验(M.R.试验)

取装有葡萄糖蛋白胨水培养液的试管,接种需培养鉴定的细菌,经过夜培养后,加入2~3滴甲基红指示剂,注意沿管壁加入,仔细观察培养液上层,若培养液上层变成红色,即为阳性反应;若仍呈黄色,则为阴性反应,分别用“+”或“-”表示。

4. 吲哚试验

① 试管标记 ? 取装有蛋白胨水培养液的试管,根据需要培养的细菌做好标记。

② 接种培养 ? 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中,第5管作空白对照不接种,置37℃恒温箱中培养24~48h。

③ 观察记录 ? 在培养液中加入5~10滴吲哚试剂,使试剂浮于培养物表面,形成两层,观察结果:如有吲哚存在,乙醚层呈现玫瑰红色,此为吲哚试验阳性反应,否则为阴性反应,阳性用“+”、阴性用“-”表示。

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关键词:细菌 生化 鉴定 定法
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