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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 反转录PCR原理及其应用

反转录PCR原理及其应用

更新:2008年11月09日 阅读次数: 【字体:

反转录PCR原理:

RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法,主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A) 选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。在实际应用中,RT—PCR又常常分为一步法RT—PCR和两步法RT—PCR。

反转录PCR的特点及应用:

  一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏,操作简便,污染率低,RNA二级结构减少,并且因为聚合酶有校正活性,从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中,反应的精确度高,人为的误差相对较小,并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA,从而更易于保存。另外,两步法的整个过程比一步法更节省费用。传统检测方法的样品用量一般在ug级,而在RT—PCR检测系统中样品用量陡降至pg级。这就在很大程度上降低了实验操作的难度,特别是mRNA样品制备的过程得以简化。

  对基因转录产物进行定性与定量的检测,相对传统的检测方法,如Northern杂交、斑点杂交( RNA dot)等而言,RT—PCR的精确度更高,且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外,还能同时分析多个差别基因的转录。在植物方面,RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响,以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。
  对基因转录中剪切与拼接的检测:如果RT—PCR引物确定了mRNA片段,根据其是否包含某个外显子,将产生两种差别DNA片段,进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点,用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。

关键词:反转录PCR RT—PCR
相关栏目:实验技术 PCR技术
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