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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 构建目的基因的真核表达载体实战操作

构建目的基因的真核表达载体实战操作

更新:2010年05月16日 阅读次数: 【字体:

目的:构建目的基因的真核表达载体

一.PCR扩增得到目的片段

1.引物的设计与合成:

这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序,其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错(此上游引物40个碱基) ,后来和这家引物公司交涉,他们拿走了我的板子,一次送了五个克隆测序,三个是上游引物出错,两个是正确的克隆,60%的出错率。

现在想想,有几点教训:

(1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大,哪家公司都这样

(2)选择一家质量可靠的公司,千万别在这省钱,引物再贵也花不了多少钱,可一轮构建下来,一测序发现引物错了,不知白扔了多少钱不说,那种心情实在是难以收拾

(3)一旦发现引物有问题,及时换公司,我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过,结果还是错,时间咱耽误不起

2.Pfu酶扩增:

(1)扩增效率低的问题:

往往taq酶扩的很好,一换成pfu就是扩不出来。解决办法:a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来),并适当增加循环数;b多试几家的pfu,总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试,总有一对能扩出来,因为pfu有外切活性,可否适当的延长引物的3’互补端;d构建中间载体:一旦用某一对引物能扩出来,把此目的片段连接t-easy中间载体,测序正确后,即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。

(2)pfu保真性的问题:

即使是pfu,也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售,价格不一。虽然都是pfu,但质量不不见得一样,在都能扩增出来的情况下,选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu,很便宜,100u才80块钱,但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱,最后花了大钱不说,还浪费了时间精力。

3.cDNA模板的问题:

在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板,因此在开始要准备足够的cDNA。100ul,200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话,就再多逆转录几管,我的RNA在-80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因,酶的问题,RNA的降解等等,但是当你做PCR做到很烦的时候,发现cDNA模板不够了,又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。

二.酶切的问题:

用于构建的酶切一定要非常充分!

新买回来的酶要分装,用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时,只要能切出来就行了,而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分,才能提高连接效率,更重要的是减少筛选时的麻烦!我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体,当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照,及时发现这一问题,另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低,导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的,所以还是建议大家新酶分装,用于“酶切鉴定”的可稍放松,用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数,并尽量减少在室温放置的时间。

三.PCR产物直接酶切:

我设计引物时保护碱基时随意的在酶切位点两侧加上了两三个g或者c的组合,做到后来才知道加保护碱基也是有说法的,不同的保护碱基会影响酶切的效率。以我随意加上的保护碱基,理论上酶切效率将极低。但做下来,前后酶切了四条不同的PCR产物,我并没有再这一步上遇到问题,我一般37℃切30到35个小时,酶切效率都不错。可见关于保护碱基的问题并不是那么绝对。

四.连接:

再这一步上我最深刻的教训就是关于做对照的问题。

第一次酶切的载体做载体自连的阴性对照,仅长出了几个克隆。为了省事,以后都省去了这一步。有两周,我连续做了两轮酶切连接筛选,总共挑了三十多个克隆,居然全是空载体!这时再补一个载体自连对照,满板子都是菌落。再换两支新酶重新切载体,回收后再自连,板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了大力气,后悔莫及。从此以后,认认真真做对照。

另外,关于连接,我是用电泳的方法大概确定载体和目的片段浓度,然后一1:5-8左右的比例配连接体系,感觉还不错。

五.粗筛:

有很多种方法,我主要用过两种:碱裂解粗提质粒后酶切,费时费力,但准确性高PCR,简单省事,但易出现假阳性。

相比之下,我更倾向于PCR。操作过程中小心一点,尽量避免各克隆之间的污染,我还习惯于加厚厚一层石蜡油,一般的我还没有遇到假阳性的情况。

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