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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 重叠PCR(Overlap PCR)的基本原理

重叠PCR(Overlap PCR)的基本原理

更新:2010年05月13日 阅读次数: 【字体:

Overlap PCR(重叠PCR)

重叠PCR的应用是非常广泛的,他的原理其实很简单:比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因,你要将他们连接到一 起,我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法,但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点,或者说我们找到了酶切位点,但这种酶非常特殊或者又很贵,我 们可能只用一次,这样购买酶就变成了一种浪费,难道没有别的办法了吗?当然有,那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因,一个命名 为A,一个命名为B。A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3,B的序列为5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物,假设引物的序列为:

A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3

A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3

B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3

B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3

我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来,我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1,我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多,为什么会这 样呢?这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列,在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。

我们来看重叠PCR的步骤:

(1)以A1,A2扩增A基因,B1,B2扩增B基因

(2)回收A,B基因

(3)以A,B为共同的模板,A1和B2为引物,扩增A+B,这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A+B呢?因为我们在设计 引物的时候使A,B有了20个互补的碱基,他们可以经过退火结合在一起,因此可以扩增出A+B.

第三步目前很多人的做法都不同,有的人是先加入模板A,B,dNTP,Buffer,水,然后进行3-5个循环的扩增,然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶,这样做的好处是可以得到特异的扩增,缺点是麻烦。另外一种方法是将引物,双模板,酶,dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管,进行反应, 好处是节省时间,不太麻烦。

目前重叠PCR的应用十分广泛,比如说在基因的定点突变,虽然说现在有很多的突变试剂盒,应用起来也很简单,但那是需要银子的;人工合成 基因,其实人工合成基因最基本的技术(目前应用最为广泛的)就是利用重叠PCR的方法;启动子与目的基因的串连;两个不同表达盒的连接,大家都知道我们在使用DNA调取或者说扩增基因的时候,往往需要将几个表达盒 串连起来观察他们的表达效果,但由于绝大多数的DNA中都含有内含子,也就是说几个外显子并不是串连在一起的,而要想达到我们的目的,只要应用重叠PCR 技术就可以轻松完成。

overlap能成功,要点是overlap的部分能保证有效的退火(形象地说,能牢固地“粘”在一块)。所以overlap的部分要有一定长度 (一般有25bp的重叠区应该够长),并且注意这部分的GC含量,以便使这部分(重叠的25bp)有一个合适的Tm值(例如65度),而且使用的PCR循 环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。

另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构!尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。 前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然,overlap区本身也有形成某种空间结构的可能(例如发夹结构),但这可以通过软件设计(如引物设计软件)来避免。

如果使用该技术还得不到全长片断,我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度, 循环几周(如三周)后降一度,然后在此温度上再循环几周,以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题,增加扩增成功的机会。

关键词:重叠PCR
相关栏目:实验技术 PCR技术
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