结果与讨论
反应动力学典型的BCA法检测方案需要体积比为20:1的BCA缓冲液和蛋白样品，NanoDrop 技术手册使用的是4ul蛋白质样品加到80ulBCA缓冲液中。即使在标准曲线的高浓度端（例如： 2mg/ml BSA），BCA工作缓冲液的活性成分的摩尔量明显超过参与反应的蛋白质（见表1）。同样也超过双缩脲反应的结合位点（肽键，半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，酪氨酸），但是这浓度的差异也是有一定限度的，因为蛋白质的三维结构会阻碍Cu2+和BCA的进入这些位点，形成大体积螯合物。因此减少蛋白质样品和BCA工作缓冲液的稀释比例应当保持反应的动力学并且保证标准曲线的工作范围能够覆盖到低蛋白浓度。
表1.蛋白标准品和BCA工作缓冲液体积比为20:1时，其中BSA标准品和BCA工作缓冲液的有效成分的浓度和摩尔量的比。
推荐的是1:1体积混合的BCA工作缓冲液和蛋白质样品，这里我们使用10ul蛋白质样品和10ulBCA工作液进行混合反应。大大减少蛋白质样品的稀释比例，并且也改变了BCA分析方法的动态范围，将检测浓度降低到0.01mg/ml.
我们修改了实验方案以适合原位微量BCA检测，2ul BSA标准品或样品，然后再滴加2ul BCA到Take3 微量板的检测孔上，合上检测板室温孵育，图4 显示了1mg/ml BSA 标准蛋白的反应进程。
图4. 562nm处检测原位微量BCA的反应进程，BSA的浓度为1.0mg/ml,孵育室温为22℃
目前大部分的BCA蛋白定量法在室温下需要2个小时进行颜色反应或提高温度（37℃或60℃）以缩短反应时间。这里我们使用了20分钟就达到满意的颜色反应。我们选择25min孵育时间使最大程度的颜色反应和4ul反应体系的最小程度蒸发达到一个平衡。
1:1反应体系灵敏度增强
图5 显示了使用反应体系为1:1的原位微量BCA法和反应体系为20:1传统的BCA法进行比较，原位微量BCA法的灵敏度要高于传统BCA方法。
图5. 使用Take3超微量多体积检测板检测分析比较原位法检测和先在离心管以20:1体积混匀再滴加到Take3板上进行检测。
原位微量BCA法灵敏度的增加和显着减少蛋白质在BCA工作缓冲液中的稀释有关，把动态检测范围延伸到更低的蛋白浓度，直至定量的极限10ug/ml BSA.和传统的20:1的反应体系相比，当蛋白浓度>=2000ug/ml时，检测的线性会受到一定的影响。这是因为稀释比例的降低将Cu2+的摩尔浓度相对于BSA浓度的过量被减少了100倍。鉴于这里有超过650个可能反应位点在BSA的一级结构中，蛋白质成为双缩脲反应的限制因素。当我们把标准曲线外推至3000ug/ml（数据没有显示）时，曲线则已经呈现平坦趋势。有鉴于此，我们推荐原位微量BCA法的标准曲线范围在10ug/mL-1000ug/mL.
提高了定量的准确性
板上有16个用于检测微孔，可以同时完成标准品和未知样品的原位定量检测，类似于微孔板中进行的实验。这样可以减少由于孵育时间和温度变化的原因带来的定量误差-已知可以影响BCA分析的变量。使用Take3板按照上图3进行排列样品，原位定量法和“Mini-BCA”法相比，原位定量的准确性有明显的提高。参见表表2. 使用原位BCA法和“Mini-BCA法”检测两个BSA样品，比较两种方法的精确性。负的%精确度表示BSA浓度被低估，相反，正的%精确度表示BSA浓度被高估了。用来计算每个样品做3次。
结论
原位微量BCA法和Mini-BCA相对于传统的20:1反应体系的BCA法，都使蛋白检测浓度范围向下延伸一个数量级。从蛋白样品和BCA工作缓冲液的角度来看，相对于Mini-BCA法，原位微量BCA法更为简单、快捷、经济。此外，原位微量BCA法在同一微量板上同时进行标准蛋白和未知样品的检测，进一步提高了定量精确性。
