将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓 冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。
反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANN HEIM的MULV反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。
cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT)，一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物，10-50pmol最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进 行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或 RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。 不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂 合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。
寻找使PCR反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我 们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为5pmol的引 物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然，最好是找到你要扩增的每个序列的最佳 引物量。没有必要用全部的cDNA反应产物进行PCR扩增。可取等分量cDNA样品用几组 不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反应物可用于研究几种不同类型的RNA。cDNA反 应物通常用PCR缓冲液衡释5倍。将cDNA的浓度隆低至0.2mM，此浓度更适于Taq聚合酶。dNTP浓度不应超过0.2mM，因为较高浓度的dDTP使Taq聚合酶的错误掺入或突变率 增高。对于扩增来说，即使dNTP的浓度低到0.05mM也不会出现问题。
镁离子浓度对反应十分重要，因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶 于含1mMEDTA的缓冲液中，EDTA可歼螯合大多数镁离子。通常，PCR反应中游离镁离子 浓度应保持在2mM。
将PCRA循环次数减少，不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度 不同的DNA的扩增。即使基因组序列得到扩增，当引物与大小不同的外显子结合时，很容易将长度不同的MRNA与基因组的产物区别一来。如果不了解基因组的结构，选用与5'编码基因间隔300-400bp的引物，脊椎动物的外显子很少大于300-400bp，因此很 容易从不同的外显子中导出引物。如果所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒 RNA转录，为了获得有关PCR的结果有必要用DNA酶彻底处理RNA。只要有很少量的基因 组DNA污染，用此方法分析就会出现假阳性结果。
