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聚合酶链反应polymeras chain reaction,PCR

更新:2014年01月03日 阅读次数: 【字体:
聚合酶链反应(polymeras chain reaction,简称PCR)是体外特异性扩增DNA分子的一项技术。它是美国Cetus公司人类遗传学研究室的科学家Kary.B.Mullis在1985年发明的。Mullis等在建立PCR方法初期,仅采用非常简单的三种温度的水浴进行实验,应用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化复性引物的延伸反应。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR;随着自动化扩增仪的发明和发展 PCR技术得到极大的推广应用,近年更是迅速渗透到生命科学的各个领域,成为分子生物学最重要的技术之一。
PCR主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段,其特异性主要由人工合成的与待扩增的DNA片段两条链两端已知序列分别互补的一对寡核苷酸引物决定。PCR反应体系由引物、微量的DNA模板,四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)溶液,耐热Taq DNA聚合酶,Mg2+及适量的缓冲液等组成。反应时首先将上述溶液加热,使模板DNA在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为复性或退火;再将温度升至中温,在Taq DNA聚合酶的催化下,以dNTP为原料,引物沿5′→3′方向延伸,合成新的DNA片段,该片段又可作下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。
 
从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。如此大量扩增的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳即可得以检测分析,另外PCR产物还可用于核酸探针杂交、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析等。
由于该法操作简单,实用性强,特异性和灵敏度高,并可自动化,因而在分子生物学、基因工程研究、以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等的基因诊断和研究中得到广泛应用。
 
一、实验目的
1.掌握PCR技术的基本原理;
2.了解应用PCR技术检测性别决定基因的基本过程。
 
二、实验原理
SRY基因位于人类Y染色体,是1990年Sinclair等克隆的睾丸决定基因,X染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物,通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段,以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断,另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。
 
三、实验准备
(一)材料
人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5ml Eppendorf管。
引物序列:
SRY1:5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′
SRY2:5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′
(二)试剂(实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理)
1.生理盐水
2.细胞裂解液
     50mmol  Tris-HCl    (pH 8.0)
     1mmol   Na2 EDTA  (pH 8.0)
     0.5%     SDS
        0.1mmol  NaCl
3.10mg/ml蛋白酶K
4.20%SDS
5.水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)
6.酚:氯仿:异戊醇(25∶24∶1)
7.氯仿:异戊醇(24∶1)
8.8mol/L 醋酸钾
9.无水乙醇
10.70%乙醇
11.TE(pH8.0)
     10 mmol/L  Tris-HCl    pH8.0
     0.1 mmol/L  Na2EDTA  pH8.0
12.10×buffer
500mmol/L KCl
100mmol/L Tris·HCl(pH8.3,室温)
15mmol/L MgCl2
0.1%    明胶
13.4×dNTP
1 mmol/L dATP、1 mmol/L dCTP、1 mmol/L dGTP、1 mmol/L dTTP
14.Taq 酶     1U/μl
15.引物溶液    10pmol/μl
16.5×TBE缓冲液(1000ml):54g Tris碱、27.5g硼酸、20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
17.DNA分子量标记
18.2%琼脂糖凝胶
19.载样缓冲液(100ml):0.2%溴酚蓝、50%蔗糖、10mol/L NaOH 1~2滴。
20.10mg/ml溴化乙锭溶液:戴手套谨慎称取溴化乙锭(分子量394.33)约200mg,放入棕色瓶中,加重蒸水20ml,溶解后置4℃冰箱保存备用。使用时100ml琼脂糖凝胶中加5μl 10mg/ml 溴化乙锭溶液,终浓度为0.5μg/ml。
(三)实验仪器
PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测仪。
 
四、实验方法与步骤
(一)DNA模板制备
方法Ⅰ:取毛发1~2根,尽量剪碎,于15~20ml生理盐水中100℃水浴10min,离心取上清备用。
方法Ⅱ:外周血提取DNA(见实验4-1人基因组DNA的提取)
(二)PCR反应体系配制及扩增
1.PCR反应总体积50μl,取一洁净的0.5ml Eppendorf管,依次加入:
重蒸馏水           23μl
10×buffer           5μl
dNTP               5μl
引物1             2.5μl
引物2             2.5μl
模板DNA          10μl
2.将上述液体混匀,95℃变性处理10min后置冰浴中,再加入2μl Taq DNA聚合酶(2U),然后加入50μl石蜡油覆盖反应液表面。
3.将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应,条件为93℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 90s共30个循环;最末一个循环紧接72℃再延伸10min。
(三)扩增产物电泳检测
1.用透明胶带封住凝胶架板两端,插入点样梳。
2.称取2g琼脂糖于三角烧瓶中,加入0.5×TBE电泳缓冲液100ml,加热使琼脂糖充分溶解,加溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml并摇匀。
3.当凝胶温度降到60℃左右时,倒入凝胶架板,去除气泡。
4.当胶凝结后,垂直拔出点样梳,将琼脂糖凝胶板放入电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液至高出胶面约1~2mm。
5.取PCR扩增产物10μl与2μl上样缓冲液混合后,仔细加入凝胶的加样槽内。DNA  Marker与PCR产物同时电泳。
6.接通电源线,打开电泳仪开关,调节电压为5V/cm,电泳约0.5h。
7.电泳结束,关闭电源,戴上手套,取出凝胶置于紫外检测仪上观察,见到的橙红色荧光条带即为DNA扩增片段。
 
五、注意事项
(一)实验过程应设阴性及阳性模板对照。
(二)PCR常见问题及解决办法
1.没有得到预期的PCR扩增产物
(1)确证聚合酶的活性是否正常。
(2)DNA解链是否充分,变性温度是否准确。
(3)引物组成是否正确,有无二级结构组成。
(4)反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在,使聚合酶或模板及产物降解,在未加Taq酶之前,将反应系统在90℃处理5~10min,有利于扩增反应顺利进行。
2.有非特异性扩增产物出现
(1)增加复性温度,缩短复性时间及延伸时间。
(2)降低引物和Taq DNA聚合酶的用量。
(3)调整Mg2+浓度。
(4)减少热循环次数。
3.形成了引物二聚体
(1)检查引物的序列,特别是3′端是否有互补区。
(2)增加引物的长度。
(3)调整引物与模板浓度,使模板比例增高,降低引物使用浓度。
(4)增加复性温度。
(5)减少热循环次数。
4.PCR产物在凝胶电泳中成片状
(1)减少Taq DNA聚合酶的用量。
(2)增加复性温度,减少复性时间及延伸时间。
(3)降低Mg2+浓度。
(4)减少循环次数。
(5)从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA,再次进行PCR反应。
(三)实验安全
溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套,这些溶液经使用后,应进行净化处理。
 
六、预期实验结果及分析
正常男性应该扩增出336bp阳性条带,如没有扩出336bp阳性条带,一般判断为正常女性或缺少SRY基因。
 
七、实验结论
通过PCR扩增SRY基因特异序列可进行性别诊断。该法亦可用于检测孕妇外周血进行胎儿性别产前诊断,从而防止X伴性隐性遗传病患儿的出生。
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