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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > PCR产物回收、纯化

PCR产物回收、纯化

更新:2013年12月31日 阅读次数: 【字体:
一、实验目的
学习使用DNA胶回收试剂盒回收、纯化琼脂糖凝胶中的DNA片段,掌握回收、纯化原理和实验操作。
二、基本原理
DNA片段的回收和纯化是基因工程操作中的一项重要技术,例如可收集特定酶切片段用于克隆或制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等。纯度和回收率是回收实验中两个最重要的技术指标:前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应;后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。
UNIQ-10柱内装有一层惰性大分子材料,它可以选择性吸附核酸物质,但不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质。通过Binding Buffer II裂解释放出DNA,然后借助UNIQ-10吸附DNA,经简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质, 最后用Elution Buffer、TE或者水洗脱DNA。
三、实验仪器
  1. 台式高速离心机4台(每8人1台)
  2. 电子天平1台
  3. 移液器16套(每2人1套)
四、实验材料 PCR技术交流论坛  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html
  1. PCR产物(即上次PCR产物电泳实验时割取的胶块);
  2. 1.5ml 离心管(无菌);
  3. 无菌枪头1ml, 200μL各10支;
五、实验步骤
  1. 在上次实验割取的胶块中加入600 μL的Binging Buffer II,置于50-60℃水浴中10min,每2min混匀一次,使胶块彻底熔化。
  2. 将熔化的胶溶液转移到套放在2 ml收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2 min。
  3. 8000 rpm室温离心1 min,取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液。
  4. 将UNIQ-10柱放入同一个收集管中,加入500 μL Wash Solution,8000rpm室温离心1min。
  5. 重复上一步洗涤一次。
  6. 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放回到同一个收集管中,12000 rpm室温离心1 min。
  7. 将UNIQ-10柱放入一个新的1.5 ml微量离心管中,在柱子膜中央加40ml Elution Buffer(或dd water,pH>7.0),室温或37℃放置2min(55-80℃洗脱效果更好)。
  8. 12000rpm室温离心1 min,离心管中的液体就是回收产物。
 
关键词:PCR 产物 回收 纯化
相关栏目:实验技术 PCR技术
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