中生网|生物技术|生物网址|生物软件|实用工具|本站导航

生物新闻

-

实验技术

-

软件教程

-

论文考试

-

肿瘤癌症

-

检验知识

-

仪器使用

-

健康知识

中生网 > 实验技术 > PCR技术 > PCR基因扩增原理及方法步骤

PCR基因扩增原理及方法步骤

更新:2013年12月31日 阅读次数: 【字体:

实验概要
PCR扩增目标DNA片段。

实验原理

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。

1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

2. 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

3. 引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。

除了典型的PCR外,人们还根据各种用途设计了各种不同的PCR。如:

RT-PCR,即在mRNA反转录之后进行的PCR。

反向PCR,常规PCR允许扩增两引物之间的DNA区段,而反向PCR则可以对靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列进行扩增。

不对称PCR,常规PCR使用的引物浓度相同,而不对称PCR使用的引物浓度不同,两种引物浓度相差100倍。在最初20各循环中,主要产物是双链DNA。当低浓度引物被耗尽后,高浓度引物引导的PCR就会产生大量单链DNA,单链DNA可用于序列测定。

主要试剂 PCR技术交流论坛  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html

1. DNA模板(1ng/μL)(质粒R-pGEX-4T-1,R指代外源基因)

PCR基因扩增原理及方法步骤


图1 pGEX-4T-1质粒示意图

2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)

3. 10×PCR缓冲液(TaKaRa)

4. 25mmol/L MgCl2(TaKaRa)

5. 引物1、引物2(5pmol/μL)

引物序列如下:

引物1:5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’

引物2:5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’

6. Taq DNA聚合酶(TaKaRa)

7. 琼指糖

8. 溴化乙锭(1%EB,终浓度0.5μg/mL)

9. DNA marker 2000(TaKaRa)

主要设备

1. PCR热循环仪

2. 琼脂糖凝胶电泳系统

3. UVP凝胶成像系统

4. 移液枪(配套枪头)
5. PCR管

实验步骤 PCR技术交流论坛  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html

1. PCR反应体系的配制,即在薄壁管内配制25μL反应体系,按下表准确加入各反应物。

反应物 体积/μL
10×PCR缓冲液 2.5
25mmol/L MgCl2 1.5
2.5mmol/LdNTP 2.0
引物1 2.0
引物2 2.0
Taq DNA聚合酶 0.2
模板DNA(1ng/μL) 2.0
加ddH2O至25μL 12.8

 


2. PCR反应条件的设置,即在PCR热循环仪上设置程序,按程序设置的条件进行扩增。

(1)94℃预变性5min;

(2)94℃变性40s;

(3)55℃退火50s;

(4)72℃延伸50s;

(5)重复步骤(2)~(4)30次;

(6)72℃延伸8min;

(7)12℃ for ever。

3. 1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果(此步骤与PCR扩增产物的割胶纯化一起进行。)

注意事项

PCR的每一个成份是如何影响PCR反应的:

1. 耐热DNA聚合酶

2. PCR反应的缓冲液

3. PCR引物
4. dNTP

5. 模板DNA

6. 温度循环参数

相关栏目:实验技术 PCR技术
 以下是对 [PCR基因扩增原理及方法步骤] 的评论,总共:0条评论
中生网-生物软件-生物技术-生物网址-实验技术-本站导航-联系我们-收藏本站
©中生网-提供生物软件免费下载,生物实验Protocol,生物网址导航。
Copyright (C)2005-2014 www.seekbio.com All Rights Reserved.