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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 重组DNA分子导入原核细胞及PCR检测

重组DNA分子导入原核细胞及PCR检测

更新:2013年12月31日 阅读次数: 【字体:
一、目的与意义
学习使用大肠杆菌感受态细胞导入外源DNA,使学生掌握DNA分子进入细胞的原理和实验操作技术; 掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。
二、实验原理
转化是指将质粒DNA或构建的重组子导入细胞的过程。细菌细胞在低温,低渗(CaCl2溶液)中膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经42℃短时间热激处理后,促进了细胞吸收DNA复合物。重组质粒转化宿主细胞后,还需要对转化菌落进行筛选鉴定,通过α互补进行筛选是最常用的鉴定方法之一。
目前实验使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列,此结构称为lacZ基因。lacZ 基因编码的α肽链与失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突变体互补,产生具有功能活性的β半乳糖苷酶分子,这种现象称为α互补。在IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)的诱导下,β半乳糖苷酶能将X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此,任何携带lacZ基因的质粒载体转化到β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,都会在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上形成蓝色菌落。当有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位点后,就破坏了α肽链的阅读框,从而无法形成α互补,不能产生具有功能活性的β-半乳糖苷酶,因此含有外源DNA片段的重组子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上是白色菌落。
PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接用菌液为摸板,通过特异引物的扩增来鉴定外源片段是否重组。
三、实验仪器 PCR技术讨论版  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html

电泳仪4台(8人1台) 微波炉
移液器16套(每2人1套) PCR仪
水平电泳槽8套(每四人1套) 超净工作台(4人1台)

四、实验材料
1、1.5 ml离心管
2、无菌枪头20 μL各2支
3、PCR管
五、实验试剂
1、溴酚兰加样缓冲液(6×): 溴酚兰0.25%,蔗糖40%
2、溴化乙锭(10 mg/ml)
3、5×TBE:Tris 碱54 g,硼酸27.5 g,EDTA-Na2·2H2O 4.65 g,加ddH2O 至1000 ml。高压湿热灭菌20 min,4℃保存备用。用前稀释至0.5×。
4、PCR所用试剂同
5、dNTP Mix (上海生工)
6、Taqase plus(北京鼎国)
7、模板DNA:20 ng/µL
8、引物(委托上海生工合成,经离心,用无菌ddH2O稀释成20 nmoI/L

CHSUP2 5’-GCGGAATTCATGGTGATGTGTACACCGTC-3’
CHSDN2 5’-GGCAAGCTTTTAGAGAGGAACGCTGTGC-3’

9、10×Taqase plus缓冲液
10、无菌ddH2O
六、实验步骤
转化:
1、取连接产物加入大肠杆菌感受态细胞中,于冰上放置30 min
2、于42℃水浴90 s(不要摇动)
3、冰上放置2 min
4、加入800 μL的LB液体培养基于37℃振荡培养1小时,在此过程中,准备培养基平板。
5、将培养液均匀涂布在含Amp、X-gal、IPTG的培养基平板上
6、将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时,然后观察结果、计算重组率。
7、对照设置(由教师完成):分别以DH5ɑ菌、含pUC19质粒的DH5ɑ菌为对照进行培养。
挑单菌落培养:
1、1.5 ml离心管中加入LB液体培养基。
2、各挑取一个含pUC19质粒的DH5ɑ菌、pUC19+外源基因重组质粒的DH5ɑ菌的单菌落于培养基中。
3、37℃培养1 hr。
菌液PCR: PCR技术讨论版  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html
1、取薄壁0.5ml PCR管2只(1只以含pUC19质粒的DH5ɑ菌为模板,另一只以pUC19+外源基因重组质粒的DH5ɑ菌为模板),用微量移液器按以下顺序分别加入各试剂。

ddH2O 15.9 µL
10×Taqase plus缓冲液 2.0 µL
dNTP Mix 0.4 µL
上游引物CHSUP2 0.5 µL
下游引物CHSDN2 0.5 µL
菌液 0.2 µL
Taq DNA 聚合酶 0.5 µL
总体积 20 μL

2、用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。在台式离心机中低速离心5秒以收集溶液于管底。
3、将加好样品的PCR管插在PCR自动扩增仪样品板上,设置反应程序。
4、94℃预变性5 min;94℃变性30 s,66.3℃退火45 s,72℃延伸90 s,共33个循环;72℃延伸10 min;4℃贮存备用。
5、PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳、拍照、记录。
相关栏目:实验技术 PCR技术
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