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PCR技术大攻略

更新:2013年11月05日 阅读次数: 【字体:

一、PCR技术及步骤

聚合酶链式反应(PCR)
PCR扩增产物的克隆

上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。

二、PCR常见问题汇总

1、没有得到扩增产物

(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。

(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。

(5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。

(6)使用PCR试剂盒时还应注意:

①是否严格按照说明书操作;

②试剂使用前是否充分混匀;

③试剂储存过久或不当而失效。
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2、扩增产物在凝胶中涂布或成片状

(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。

(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

(4)循环次数过多;增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。

(5)退火温度过低。

(6)电泳体系有问题:

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;

②凝胶没有凝固好;

③琼脂糖质量差。

(7)若为PCR试剂盒则可能:?

①由于运输储存不当引起试剂盒失效;

②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。

(8)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
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3、溴酚蓝前有区带(很宽)

(1)模板量太低。增加模板DNA的用量。

(2)循环次数太多。减少循环次数。

(3)复性度偏低。提高复性温度。

(4)预变性后没有立刻上机循环。

(5)引物3'端是否互补;重新设计合成较长的引物。

(6)引物用量偏多。降低引物的使用量。
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4、扩增产物出现多条带

(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。

(5)样品处理不当。

(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。

(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
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5、PCR假阳性结果

(1)引物设计不当,应调换引物。

(2)循环参数不合适,导致非特异性扩增。

(3)靶序列的交叉污染。


6、PCR假阴性结果

(1)引物长度不够。

(2)试剂浓度不标准。

(3)靶序列如突变、缺失等。

(4)循环参数设置错误。

(5)标本中有Taq酶抑制剂。

(6)PCR产物检测系统灵敏度不够。

PCR扩增产物的克隆

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三、PCR经验总结

1、增加PCR的特异性

(1)primers design

这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件:

a ?足够长,18-24 bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量;

b ?GC% 40%~~~~60%;

c ?5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性;

d ?避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC;

e. 避免3'端的互补,否则容易造成DIMER。

f. 避免3'端的错配;

g. 避免内部形成二级结构;

h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端,,在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补和二级结构是要加上它们;

i. 需要使用兼并引物时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM);

j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.


* 引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
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设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
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根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
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为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
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关键词:技术
相关栏目:实验技术 PCR技术
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