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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 查尔酮合成酶基因的克隆

查尔酮合成酶基因的克隆

更新:2013年12月31日 阅读次数: 【字体:
一、实验目的与意义
学习PCR操作技术,利用基因全长引物,扩增出查尔酮合成酶基因的全长,使学生掌握PCR的基本原理和操作。
二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。因此,PCR技术是生物和医学等领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成:①模板DNA的变性:模板DNA加热至93℃左右,双链变为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的链,重复变性--退火--延伸这三个过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2-4分钟,2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、实验仪器
0.5ml薄壁PCR管 PCR仪(Thermo)
微量移液器 电泳仪
水平电泳槽 凝胶成像分析系统
台式高速离心机1台(每8人1台)
三、实验试剂 PCR技术交流论坛  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html
1.dNTP Mix (上海生工)
2.Taqase plus(北京鼎国)
3.模板DNA:20 ng/µL
4.引物(委托上海生工合成,经离心,用无菌ddH2O稀释成20 nmoI/L
CHSUP2 5’-GCGGAATTCATGGTGATGTGTACACCGTC-3’
CHSDN2 5’-GGCAAGCTTTTAGAGAGGAACGCTGTGC-3’
5.10×Taqase plus缓冲液
6.无菌ddH2O
四、实验步骤
(一)准备PCR反应溶液
1.取薄壁0.5ml PCR管两只,用微量移液器按以下顺序分别加入各试剂。
ddH2O 14.6 µL
10×Taqase plus缓冲液 2.0 µL
dNTP Mix 0.4 µL
上游引物CHSUP2 0.5 µL
下游引物CHSDN2 0.5 µL
模板DNA  (20ng/µl) 1.5 µL
Taq DNA 聚合酶 0.5 µL
总体积 20 μL
查尔酮合成酶基因的克隆2.用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。在台式离心机中低速离心5秒以收集溶液于管底。
(二) PCR扩增反应
将加好样品的PCR管插在PCR自动扩增仪样品板上,设置反应程序。
94℃预变性5 min;94℃变性30 s,66.3℃退火45 s,72℃延伸90 s,共33个循环;72℃延伸10 min;4℃贮存备用。
(三) 电泳检测
将20 µl产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳,目的条带应位于1200 bp处。
(四)割胶
割取含目的条带的胶块,置于洁净的1.5 ml 离心管中,写上班级、学号,放于4℃贮存备用。
相关知识: PCR技术交流论坛  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html
PCR的最早设想:核酸研究已有100多年的历史,上世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现:1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的MμLlis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给 DNA的体外合成提供合适的条件——摸板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系,以及DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善:MμLlis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之 间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于 Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率,增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
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