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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 逆转录PCRRT-PCR扩增基因特异片段

逆转录PCRRT-PCR扩增基因特异片段

更新:2014年01月02日 阅读次数: 【字体:
逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段
 
一、实验原理
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。www.ebioe.com
二、实验试剂
Taq酶,M-MLV逆转录酶,dNTPs, DEPC处理水,双蒸水,大肠杆菌总RNA
三、实验仪器
电泳仪, PCR仪,高速离心机,移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪
 
四、操作步骤
1.cDNA的合成:
逆转录体系的组成:
逆转录PCRRT-PCR扩增基因特异片段

2.PCR扩增特异性片段
 
 
(1)25ul PCR体系的组成:
 
组分                              体积                       
10×PCR Buffer                                      2.5μL
dNTPs (2.5mM,each)                           2μL
Sense primer                                         1μL
Antisense primer                                    1μL   
cDNA                                                   1μL
DEPC处理水                                        17 μL 
Taq 酶                                                  0.5μL

 

 
 
 
  1. PCR 条件:
逆转录PCRRT-PCR扩增基因特异片段

3.琼脂糖凝胶电泳检测
 
五、实验注意事项
 
  1. 整个操作始终注意避免RNA酶的污染;
  2. PCR反应灵敏,注意避免试剂污染;
  3. 酶易失活,整个操作注意在冰上进行。
 
相关栏目:实验技术 PCR技术
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