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中生网 > 实验技术 > PCR技术 > 目的基因的PCR扩增

目的基因的PCR扩增

更新:2015年03月14日 阅读次数: 【字体:

实验原理

PCR(聚合酶链式反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括3个基本步骤:⑴变性:目的双链DNA片段在94℃下解链;⑵退火:两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;⑶延伸:在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

实验试剂


Taq酶 
相应引物 
dNTP等

实验步骤

1.PCR反应
 (1) 所用溶液融化后置于冰上。
 (2) 依次混匀下列试剂:

25μl      10×PCR buffer

15μl      25mmol/L MgCl2

25μl      4种dNTP

5μl       引物1

5μl       引物2

124μl     ddH2O

1μl       Taq 酶  

     混匀后离心5秒种。      
   (3) 分成10管,每管各加5μl模板DNA(约1ng),编号。
  (4) 混匀后离心5秒种,PCR扩增。
  (5) 参数设定

T (℃)

Duration

Cycle

94

2   min

1

94

0.5  min

30

55-60

0.5  min

72

1   min

72

10  min

1

4

2   hr

storage

2. 电泳

取10μl扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

注意事项


1. PCR反应非常灵敏,操作应尽量在无菌操作台中进行。
2. 吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要相互污染试剂。
3. 试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

关键词:目的 基因 扩增
相关栏目:实验技术 PCR技术
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